GC-MS法分析檸檬蒸餾酒與發酵酒揮發性風味物質

文凌云，徐祥林，趙 冬，孫 卉，陳艷萍，柏羽純，何志貴*

（1.桂林旅游學院 休閑與健康學院，廣西 桂林541006；2.廣西桂林銳德檢測認證技術有限公司，廣西 桂林541100）

檸檬（Citrus limon（L.）Burm.f.）為蕓香科柑橘屬植物，又稱檸果、洋檸檬、益母果等，不僅含有豐富的檸檬酸，而且含有豐富的營養物質，如類黃酮、維生素C、維生素A、維生素E以及Ca、Fe、Zn等多種微量元素，因而具有極高的營養價值和藥用價值[1]。檸檬亦被譽為保健水果，可降低膽固醇、預防高血壓、心臟病、心血管硬化、口腔潰瘍、壞血病、防止結石[2-4]。用檸檬汁釀造的檸檬酒，不僅可保留檸檬原有的特殊香味，且口感良好、營養豐富[3]。檸檬酒的制作與生產已成為檸檬加工產業的重要途徑[5-6]。

目前，國內對檸檬酒的研究主要集中在其發酵工藝的優化[1，4，7-9]、發酵菌株的篩選[5]、降酸工藝[6]和澄清工藝等方面[3]。國外研究主要集中于檸檬的揮發性成分及其生物活性[10-12]以及檸檬的功效[13]等方面。針對檸檬酒的揮發性香味物質的研究極少，并且揮發性物質成分及含量是檸檬酒品質和安全的重要指標之一[14]。

因此，本研究采用定量描述性感官評價法對檸檬發酵酒與蒸餾酒進行感官評定，參照相關國標方法對其主要理化指標（總酸、還原糖、可溶性固形物含量）進行檢測，并采用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術對其揮發性風味成分進行分析，以期為提高檸檬酒的品質和安全提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品檸檬蒸餾酒和檸檬發酵酒：中國科學院廣西植物研究所植物功能物質研究與利用重點實驗室。

1.1.2 主要試劑二氯甲烷（色譜純）、無水硫酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、酚酞（指示劑）、鹽酸、五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸（均為分析純）：西隴科學股份有限公司；亞甲藍（指示劑）：國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖標準品（純度≥99%）：成都西亞試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

WYA-2S數字阿貝折射儀：上海精密科學儀器有限公司；Agilent7890B-7000C氣相色譜質譜儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 檸檬酒感官評價

參考牛云蔚等[15-16]的方法進行感官評價，并進行一定改良。選取10點制，0～9分（0分=沒味道，9分=味道最強）。評價小組由10人（5男，5女，年齡在23～30歲之間）組成。評價人員根據相關標準進行培訓，分別對檸檬蒸餾酒和發酵酒的4種感官屬性（酸、甜、苦、澀）進行評價，每個樣品重復評價3次。

1.3.2 檸檬酒理化指標測定

參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的滴定法測定總酸含量；參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》中的直接滴定法測定還原糖含量；參照GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》中的折光計法測定可溶性固形物含量。以上理化指標均重復測定3次。

1.3.3 檸檬酒揮發性成分分析

準確量取100 mL樣品置于分液漏斗中，加入等量二氯甲烷，搖勻，萃取，靜置分層后，放出下層萃取液，重復萃取3次，合并3次萃取液，用無水硫酸鈉除去多余水分，采用濃縮儀濃縮至1 mL后，將其定容至5 mL，并用0.22 μm的有機濾膜過濾，采用GC-MS分析揮發性成分[17]。

氣相條件：HP-5MS彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度250 ℃，分流比20∶1，流速1.2 mL/min，進樣量1 μL。程序升溫：初始60 ℃維持5 min，再以5 ℃/min升至240 ℃保持30 min，后運行260 ℃維持3 min。

質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，離子源溫度為250 ℃，電子能量為70 eV，溶劑延遲時間3.5 min，全掃描模式。

定性定量分析：使用工作站軟件NIST MS進行數據處理，運用NIST 14譜庫與樣品色譜峰進行比對分析，并結合保留指數（retention index，RI）進行定性分析。采用面積歸一化法進行定量分析，確定各揮發性物質的相對含量。

1.3.4 數據處理

所有實驗數據均重復測定3次，所得結果用“平均值±標準偏差”表示。實驗數據采用Excel和SAS 9.3統計軟件進方差分析和差異顯著性分析，顯著性水平取P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 檸檬酒感官評價結果

感官屬性（酸、甜、苦、澀）可以較好的解釋酒的口感和味道特征。品評人員主要從酸、甜、苦、澀4個屬性對檸檬發酵酒和蒸餾酒的感官特征進行描述，結果見表1。由表1可知，檸檬發酵酒中酸味值（5.167分）最高，甜味值（2.267分）最低，苦味值（3.733分）和澀味值（3.567分）居中。而檸檬蒸餾酒中澀味值（5.267分）最高，甜味值（2.633分）最低，苦味值（4.967分）和酸味值（4.067分）居中。兩種酒樣除澀味存在顯著差異外（P＜0.05），其他3種屬性均無顯著差異（P＞0.05）。這表明這兩種酒的口感差別主要是由澀味屬性引起的。

表1 檸檬酒感官評定結果Table 1 Results of sensory evaluation of lemon wine

2.2 檸檬酒理化指標分析結果

對檸檬發酵酒和檸檬蒸餾酒的總酸含量、還原糖含量及可溶性固形物含量進行測定，結果見表2。由表2可知，檸檬發酵酒中，總酸含量為6.78 mg/mL，可溶性固形物含量為6.07%，還原糖含量0.16 mg/mL，檸檬蒸餾酒中，總酸含量為0.18 mg/mL，可溶性固形物含量為19.3%，還原糖含量0.07 mg/mL。兩種酒樣在總酸含量、還原糖含量以及可溶性固形物含量具有明顯的差異性（P＜0.05）。

表2 檸檬酒的理化指標Table 2 Physicochemical indicators of lemon wine

2.3 檸檬酒揮發性風味化合物分析結果

2.3.1 檸檬發酵酒與蒸餾酒揮發性風味化合物種類及相對含量的差異

由表3可知，通過GC-MS聯用技術從檸檬發酵酒中共檢測出40種揮發性化合物，其中酯類物質種類最高，為20種；其次是醇類和酸類化合物，均為9種；醛類化合物種類最少，僅為2種。4類揮發性化合物的相對含量為酯類（53.63%）＞醇類（27.48%）＞酸類（12.93%）＞醛類（5.96%）。由表4可知，檸檬蒸餾酒中共檢出33種揮發性化合物，其中酯類物質種類數量最多（15種），其次為醇類化合物（5種）、酸類化合物（4種）、雜環類（3種）和烷烴類（3種），烯類（2種）和醛類（1種）較少。7類揮發性化合物的相對含量為酯類（48.43%）＞烯類（27.78%）＞醇類（14.74%）＞酸類（4.19%）＞烷烴類（2.71%）＞雜環類（1.86%）＞醛類（0.29%）。兩種檸檬酒揮發性化合物中，酯類化合物的種類和相對含量均最高，醛類化合物含量均最低。

表3 檸檬發酵酒中揮發性風味化合物組成及相對含量Table 3 Components and relative content of volatile flavor compounds in fermented lemon wine

表4 檸檬蒸餾酒中揮發性風味化合物組成及相對含量Table 4 Components and relative content of volatile flavor compounds in distilled lemon spirit

續表

2.3.2 酯類化合物比較

兩種檸檬酒中酯類化合物的相對含量均最高。檸檬發酵酒中酯類化合物有20種（相對含量為53.63%），主要包括辛酸乙酯、琥珀酸單乙酯、α-乙酸松油酯、9-十六碳烯酸乙酯等；檸檬蒸餾酒中酯類化合物有15種（相對含量為48.43%），主要包括辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、月桂酸乙酯、十六酸乙酯等。兩種檸檬酒中的酯類化合物均以辛酸乙酯相對含量最高，分別為21.74%和25.14%。辛酸乙酯是具有梨子香味的揮發性化合物[18]。兩種檸檬酒的其他成分差異較大，可能是構成二者香味差異的重要原因。

酯類化合物是酒體中最活躍的成分，是果酒整體香氣形成的重要組成部分。酯類物質大多賦予果酒水果香氣，如辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、檸檬酸三乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯均具有類似水果香味的香氣，可使酒變得香醇清甜[18]，是檸檬發酵酒香味的重要來源。

2.3.3 醇類化合物比較

檸檬發酵酒中的醇類物質所占比例僅次于酯類物質，相對含量為27.48%，共檢測出9種；而檸檬蒸餾酒中醇類化合物相對含量為14.74%，共檢測出5種。醇類化合物是果酒重要的芳香組分，高級醇類物質主要是微生物通過降解代謝途徑（Ehrlich代謝機制）和合成代謝途徑（Harris代謝機制），通過相應α-酮酸的脫羧作用與加氫還原而實現的[19]。醇類化合物可使果酒香氣濃厚豐滿，同時也是形成酯類化合物的前體物質，主要呈現清香和青鮮香氣[20-21]。兩種檸檬酒的醇類物質中的對羥基苯乙醇、苯乙醇相對含量均較高，并均檢測出α-松油醇。苯乙醇是酵母菌發酵的特有產物，本身也具有玫瑰香氣[21]；α-松油醇有持久的紫丁香香氣，對檸檬酒香氣的形成具有積極作用[23]。其他醇類化合物，除了異蒲勒醇具有樟腦和薄荷香氣外，其余均無明顯的香氣，但它們也是構成檸檬酒的重要組成成分。

2.3.4 酸類化合物比較

酸類化合物主要是有機酸，其含量的高低對果酒的感官品質有較大影響[24]。檸檬發酵酒中共檢測到酸類化合物9種，相對含量為12.93%，主要包括4-酮庚乙酸、肉豆蔻酸、（S）-（+）-檸蘋酸、L-蘋果酸、4-羥基苯基-甘氨酸、油酸、丁酸、7-辛烯酸、對羥基肉桂酸。檸檬蒸餾酒中共檢測到酸類化合物4種，相對含量為4.19%，主要包括正癸酸、肉豆蔻酸、月桂酸、纈草酸。雖然酸類化合物的呈香貢獻較小，但可以協調果酒的口感等作用[25]。

2.3.5 其他類化合物比較

檸檬發酵酒和蒸餾酒中醛類物質相對含量分別為5.96%、0.29%，相對含量均最低。檸檬發酵酒中檢測到的醛類化合物主要是丙醛二乙基乙縮醛和3-乙氧基-4-丙氧基苯甲醛；檸檬蒸餾酒中檢測到的醛類化合物是對甲基苯甲醛。雖然揮發性醛類化合物在檸檬酒中的含量有限，但是也對其香氣特征做出了重要的貢獻[26]。此外，在檸檬蒸餾酒中檢測到烷烴類、烯類和雜環類物質。其中烷烴類物質包括1,1,2,2-四氯乙烷、2,2-二甲基辛烷、2,6,11-三甲基十二烷；烯類物質包括D-檸檬烯、β-石竹烯和3-甲基-6-（1-甲基乙亞基）環己烯；雜環類物質包括1-（7-氧雜雙環[4.1.0]庚-1-基）乙酮和3,2',4'-三羥基-4-甲氧基查耳酮。烯類物質在檸檬蒸餾酒中的相對含量僅次于酯類物質，其中D-檸檬烯相對含量為22.15%。D-檸檬烯又稱苧烯，是一種環狀單萜烯，具有較強的令人愉悅的檸檬樣香氣但留香時間很短。

3 結論

通過定量描述性感官評價法對檸檬發酵酒和蒸餾酒進行感官評定發現，2種檸檬酒樣除澀味存在顯著差異外（P＜0.05），其他3種屬性均無顯著差異（P＞0.05），均以苦、澀、酸味為主，甜味評分最低。通過理化指標檢測發現，2種檸檬酒的總酸、還原糖和可溶性固形物含量都具有顯著性差異（P＜0.05）。采用GC-MS技術對其揮發性物質組分分析發現，從檸檬發酵酒與蒸餾酒中分別檢測出40種、33種揮發性風味物質，且均以酯類物質種類（20種、15種）及相對含量（53.63%、48.43%）最高，與檸檬發酵酒相比，除檢測到酯類、醇類、酸類、醛類物質外，檸檬蒸餾酒中還檢測到烷烴類、雜環類及烯類物質。