刺葡萄園土壤釀酒酵母的篩選及耐受性分析

譚 沙，雷 孝，翁 盼，趙克芳，田 怡，陳雪英，張艷丹，朱仁威

（1.銅仁學院 材料與化學工程學院，貴州 銅仁554300；2.佛山科技技術學院 食品科學與工程學院，廣東 佛山556300）

刺葡萄（Vitis davidiivar.davidii）是葡萄屬東亞群下的一個種，為我國南方主要野生普通品種之一[1]，是我國特有的珍貴野生葡萄品種[2]。由于刺葡萄的枝條上密布皮刺，故稱刺葡萄[3]。刺葡萄對于生長環境的適應性非常強，具有較好的高溫、高濕耐受性，抗病能力強，栽培上施用農藥較少，深得消費者喜愛[4]。“紫秋”是從我國南方野生刺葡萄資源中選育出來的栽培品種[5-6]，與其他葡萄相比，刺葡萄果粒小、果皮厚，酸度高，其適合于加工成其他產品，而目前刺葡萄大多數主要用于鮮食[7-8]，存在附加值低、產品單一的問題。目前釀酒技術中，多數以引入酵母釀造，但引入酵母由于外界條件的變化，在刺葡萄酒釀造過程中并不一定能完全表現出其優良性狀，或不能完全體現產地刺葡萄酒的品質和特色[9-10]。王瑞琛等[11]從自然發酵刺葡萄酒中篩選得到1株發酵性能良好的酵母菌株，而由于地域的差異，刺葡萄營養成分的差異，篩選的刺葡萄酒酵母并不適用于刺葡萄酒的生產。

基于此，本試驗擬從銅仁區域刺葡萄種植基地的土壤中采集試驗樣品，從中分離純化獲取酵母菌株，篩選出適合銅仁區域刺葡萄酒釀造的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），對改善刺葡萄酒品質有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

刺葡萄園土壤樣品：貴州省銅仁市川硐鎮塢泥刺葡萄園。

1.1.2 試劑

乙醇（分析純）：山西艷陽升華有限公司；無水葡萄糖、檸檬酸（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠；偏重亞硫酸鉀（分析純）：山東西亞化學工業有限公司；氯化鈉（分析純）：成都金山化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液（固）體培養基、WL營養瓊脂培養基：青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

SPX-150恒溫培養箱：金壇市三和儀器有限公司；HZQQA恒溫振蕩培養箱：蘇州威爾實驗用品有限公司；SHA-B數顯水浴恒溫振蕩器：北京科偉永興儀器有限公司；DHG-9070A電熱鼓風干燥箱：常州普天儀器制造有限公司；YXQLS-100G高壓蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；JH-1超凈工作臺：安徽杰克歐德實驗室設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母菌株的分離

稱取10 g土樣于無菌三角瓶中，加入200 mL無菌水，28 ℃、200 r/min條件下培養20 min，制成菌落懸液。在無菌操作下，使用10倍稀釋法[12-14]進行梯度稀釋，選取稀釋度為10-3、10-4、10-5的稀釋液涂布于YPD固體培養基，28 ℃恒溫培養48 h。以其菌落顏色、直徑大小、透明度、厚薄程度等[15]選擇典型酵母菌落，多次劃線純化，得到單菌落。將分離純化的酵母菌分別接種到YPD斜面培養基上，28 ℃條件下培養48 h，轉至冰箱4 ℃保存。

1.3.2 釀酒酵母的篩選

在無菌條件下，將篩選出的酵母菌株接種于YPD液體培養基中，28 ℃、200 r/min條件下培養24 h[16]。取0.2 mL菌液接種到WL營養瓊脂培養基中，28 ℃條件下培養5 d，觀察記錄菌落的顏色、形態特征，并對篩選得到的菌株進行分類，分類依據見表1[17-19]。

表1 WL營養瓊脂培養基上酵母菌的分類依據Table 1 Basis of classification for yeasts on WL nutrient agar media

1.3.3 釀酒酵母耐受性研究[20-21]

將篩選得到的釀酒酵母菌株接種于乙醇體積分數分別為10%、12%、14%、16%、18%；葡萄糖質量濃度分別為200 g/L、300 g/L、400 g/L、500 g/L、600 g/L；檸檬酸質量濃度分別為10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L；溫度分別為5 ℃、10 ℃、15 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃；SO2質量濃度分別為100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L的YPD液體培基，28 ℃條件下靜置培養7 d。分別取0.2 mL菌液接種于YPD固體培養基，28 ℃條件下恒溫培養3 d，觀察并記錄平板上菌落的生長情況，分別考察菌株的乙醇、糖、酸、溫度及SO2耐受性。

2 結果與分析

2.1 酵母菌株的分離鑒定

經過YPD平板涂布以及多次劃線培養后，根據其菌落顏色、直徑大小、透明度、厚薄程度，從刺葡萄園土壤中初步分離篩選得到10株酵母菌，并命名為TR-1、TR-2、TR-3、TR-4、TR-5、TR-6、TR-7、TR-8、TR-9、TR-10，其菌落形態見圖1A。將10株酵母菌分別接種于WL營養瓊脂培養基中，28 ℃條件下培養5 d后對其菌落顏色、形態特征進行觀察，結果見圖1B。

由圖1A可知，菌株TR-2、TR-3、TR-4、TR-5、TR-6、TR-7、TR-8、TR-9、TR-10這9株菌株的菌落形態均為表面光滑、濕潤、粘稠，易挑取，菌落質地均勻，正反面和邊緣、中央部位的顏色均一、呈乳白色，其中菌株TR-2、TR-6、TR-10有酒精味散發。菌株TR-1的菌落形態表面光滑、濕潤、易挑取、菌落質地均勻、中央部位的顏色均一、呈淡紅色。

由圖1B可知，菌株TR-2、TR-3、TR-6、TR-7、TR-10的菌落顏色為奶油色帶綠色，菌落形態為球形突起，表面光滑，不透明、奶油狀；菌株TR-4、TR-9的菌落顏色為深綠色，菌落很小，表面光滑，不透明、黃油狀；菌株TR-1、TR-5、TR-8的菌落顏色為白色帶綠色，菌落形態為扁平、表面褶皺、粗糙、中間火山狀褶皺。參照表1，對其進行分類，結果見表2。

由表2可知，將分離得到的10株酵母菌株分為3種酵母，其中，菌株TR-2、TR-3、TR-6、TR-7、TR-10均為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），菌株TR-4、TR-9均為粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe），菌株TR-1、TR-5、TR-8均為克魯維畢赤酵母（Pichia kluyver）。

圖1 10株酵母菌菌株在PDA（A）及WL營養瓊脂（B）培養基上的菌落特征Fig. 1 Colony characteristics of 10 yeast strains on the PDA(A) and WL nutritional agar (B) media

表2 WL營養瓊脂培養基篩選酵母分類結果Table 2 Classification results of yeasts screened by WL nutrient agar media

2.2 釀酒酵母的耐受性研究

2.2.1 乙醇耐受性實驗

釀酒酵母對高濃度酒精脅迫的耐性是葡萄酒釀造過程中的重要特性，耐酒精能力強可以使釀造過程發酵完全，提高葡萄酒的酒精度[22]。酒精對細胞的抑制作用很復雜，主要表現在抑制酵母的增殖速度、存活性和發酵力3個方面[22]。5株釀酒酵母菌株的乙醇耐受性實驗結果見表3。

表3 5株酵母菌株的乙醇耐受性Table 3 Alcohol tolerance of 5 yeast strains

由表3可知，5株酵母菌株均能在乙醇體積分數為10%、12%的培養基中生長，并且生長良好。隨著乙醇體積分數的增加，5株酵母菌株對不同體積分數乙醇的耐受性有明顯的差異，其中菌株TR-7可在乙醇體積分數為14%的培養基中生長，菌株TR-6、TR-10可在乙醇體積分數高達16%的培養基中生長。由此可知，菌株TR-6、TR-10的乙醇耐受性最好。

2.2.2 糖耐受性實驗

葡萄酒釀造過程中，糖是酒精發酵的基質，也是酵母賴以生存的能源物質，但是高濃度糖會對酵母有抑制作用[8]。5株酵母菌株的糖耐受糖性實驗結果見表4。由表4可知，在葡萄糖質量濃度為200～300 g/L時，5株酵母菌株生長良好，但隨著葡萄糖質量濃度的增加各菌株的生長表現出一定的差異性，當葡萄糖質量濃度為500 g/L時，只有菌株TR-6、TR-10可以生長，當葡萄糖質量濃度為600 g/L時，只有菌株TR-10生長。由此可知，菌株TR-6、TR-10的糖耐受性較好。

表4 5種酵母菌株的糖耐受性Table 4 Glucose tolerance of 5 yeast strains

2.2.3 酸耐受性實驗

5株酵母菌株的耐酸性實驗結果見表5。

表5 5株酵母菌株的酸耐受性Table 5 Acid tolerance of 5 yeast strains

由表5可知，當檸檬酸質量濃度為10～20 g/L時，5株酵母菌株均能生長，且菌株TR-3、TR-6、TR-7、TR-10生長良好；當檸檬酸質量濃度為25 g/L時，僅有菌株TR-3、TR-6、TR-10能生長，且菌株TR-6、TR-10生長良好；當檸檬酸質量濃度為30 g/L時，僅有菌株TR-6和TR-10能生長，且菌株TR-10生長良好。由此可知，菌株TR-3、TR-6、TR-10的酸耐受性較好。

2.2.4 溫度耐受性實驗

5株酵母菌株的溫度耐受性實驗結果見表6。由表6可知，當培養溫度為5 ℃時，菌株TR-6、TR-7、TR-10可以生長，但生長一般；當培養溫度為10～35 ℃時，5株酵母菌株均能生長，但隨著培養溫度的升高，這5株酵母菌株對高溫耐受性表現出一定差異，當溫度為45 ℃時，僅有菌株TR-3、TR-6、TR-10可以生長，且菌株TR-6生長良好；當培養溫度為55 ℃時，所有菌株均不能生長。由此可知，菌株TR-6和TR-10既可在低溫為5 ℃條件下生長，又可耐受45 ℃，溫度耐受性較好。

表6 5株酵母菌株的溫度耐受性Table 6 Temperature tolerance of 5 yeast strains

2.2.5 SO2耐受性實驗

在葡萄酒釀過程中，添加適量SO2的目的是抑制有害微生物的生長、阻止葡萄汁的氧化作用、加速膠體的凝集以及有利于葡萄汁澄清，在釀造過程中被廣泛使用[9]。5株酵母菌株的SO2耐受性實驗結果見表7。由表7可知，當SO2質量濃度為100～200 mg/L時，5株菌株均生長良好；當SO2質量濃度為250 mg/L時，菌株TR-3不能生長；當SO2質量濃度為300 mg/L時，只有菌株TR-10可以生長。由此可知，菌株TR-2、TR-6、TR-7、TR-10這四株的SO2耐受性較強。

表7 5株酵母菌株的SO2耐受性Table 7 SO2 tolerance of 5 yeast strains

綜上，菌株TR-6和TR-10的耐受性較好，均分別能在乙醇體積分數為16%、葡萄糖質量濃度為500 g/L、檸檬酸質量濃度為30 g/L、SO2質量濃度為250 mg/L的YPD液體培養基和高溫45 ℃、低溫5 ℃條件下生長繁殖。

3 結論

從銅仁市川硐鎮塢泥刺葡萄園土壤中共分離、篩選得到5株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），其中菌株TR-6和TR-10的耐受性較好，均分別能在乙醇體積分數為16%、葡萄糖質量濃度為500 g/L、檸檬酸質量濃度為30 g/L、SO2質量濃度為250 mg/L的YPD液體培養基和高溫45 ℃、低溫5 ℃條件下生長繁殖，為后續選育出適合釀造刺葡萄酒的酵母菌奠定基礎，對今后釀造具有獨特風格的刺葡萄酒及促進銅仁地區的刺葡萄資開發利用和產業化生產有非常重要的意義。