晴隆酸菜發酵過程中微生物菌群多樣性動態分析

郭倩倩，盧 彪

（興義民族師范學院 生物與化學學院，貴州 興義562400）

酸菜是一種深受國人喜愛的蔬菜發酵食品，在我國很多地方都有自己特色的發酵蔬菜制品，如東北酸菜[1]、四川的老壇酸菜[2]和涼山的無鹽酸菜[3]等。由于發酵工藝不同，發酵體系中的微生物群落結構、風味特性和質地均有不同[4]。而且自然發酵的產品，由于其發酵微生物均來源于發酵原料與發酵環境[5]，因此研究發酵食品中的微生物組成以及發酵過程中微生物的動態變化是了解發酵食品中微生物之間的相互作用、揭示食品風味與發酵菌群的關系、保持產品穩定性的關鍵。

近年來對發酵微生物多樣性的研究已經逐步成為酸菜研究的熱點。谷懿寰等[6]利用傳統分離技術、16S rRNA以及熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術對30份不同地域和種類的海南發酵蔬菜進行研究，共得到乳桿菌屬、腸球菌屬和片球菌屬的16個屬172 株乳酸菌，通過數量分析得出海南發酵蔬菜的優勢屬為乳桿菌屬，優勢種為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；折米娜等[7]利用高通量測序技術與變性梯度凝膠電泳相結合的技術對施恩地區酸菜水中的細菌多樣性進行了研究，結果表明，乳桿菌屬為優勢菌屬，含量達76.25%，優勢乳酸菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。吳進菊等[8]利用高通量測序分析了湖北襄陽大頭菜發酵過程中真菌的多樣性，結果表明，發酵前期明梭孢屬（Monographella）為優勢菌屬，發酵中期和后期德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）和接合酵母屬（Zygosaccharomyces）為優勢菌屬。本研究為了全面的了解晴隆酸菜中發酵微生物的動態變化，采用高通量測序的方法對晴隆酸菜發酵過程中細菌和真菌進行了種屬分類以及群落結構的動態分析，研究了晴隆酸菜各發酵時期的優勢發酵菌群及菌落結構，為研究晴隆酸菜風味與微生物之間的關系、保持晴隆酸菜生產的穩定性提供了理論依據，同時也可以為其他發酵食品的研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自然發酵晴隆酸菜：實驗室自制；E.Z.N.A.RSoil 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）試劑盒：美國OMEGA公司；2×HieffRRobust PCR Master Mix、Hieff NGSTMDNA Selection Beads：中國Yeasen公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒：美國Life公司。

1.2 儀器與設備

ETC-811 PCR儀：北京東勝創新生物科技有限公司；FR-1000凝膠成像系統：上海復日科技有限公司；Q32866 QubitR3.0熒光計：美國Invitrogen公司；Research plus 0.5～10.0μL移液器：德國Eppendorf公司；DYY-6C電泳儀、DYCZ-21電泳槽：北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 晴隆酸菜的制備

以晴隆芥菜為發酵原料，利用傳統土陶壇為發酵容器，經清洗、干燥脫水（60 ℃熱風干燥2 h）、加鹽（8%）揉搓腌漬，加糖（4%），密封發酵28 d，即得晴隆酸菜。

1.3.2 酸菜樣品采集及發酵菌體收集

分別采取自然發酵7 d（前期）（T1）、14 d（中期）（T2）、21 d（后期）（T3）、28 d（末期（成品）T4）晴隆酸菜樣品各500 g，分別編號為T1、T2、T3、T4。

將2 g酸菜樣品放入5 mL樣品管，加入適量磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）進行表面振蕩沖洗，收集PBS沖洗液，12 000 r/min離心2 min后用移液槍小心吸除上清液，留取沉淀菌體。

1.3.3 基因組DNA的提取與檢測

用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA提取試劑盒對收集的菌體進行DNA的提取，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。

1.3.4 PCR擴增

提取的基因組DNA通過Qubit3.0 DNA檢測試劑盒精確定量后，作為模板進行PCR第一輪擴增。

第一輪PCR擴增引物分別為Nobar_341F：CCTACGGGNGGCWGCAG，Nobar_805R GACTACHVGGGTATCTAATCC（細菌）；ITS1F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA，ITS2：GCTGCGTTCTTCATCGATGC（真菌）。第一輪擴增體系：2×HieffRRobust PCR Master Mix 15 μL，Primer F 1 μL，Primer R1 μL，基因組DNA 10 ng；加水至30 μL。第一輪擴增條件：94 ℃，3 min→（94 ℃，30 s→45℃，20 s→65 ℃，30 s）5個循環→（94℃，20s→55℃，20s→72℃，30 s）20個循環→72 ℃，5 min→10 ℃，∞。

以第一輪擴增的PCR產物為模板進行第二輪PCR擴增。第二輪PCR擴增引物分別為341F：CCTACGGGNGGCWGCAG，805R：GACTACHVGGGTATCTAATCC（細菌）；ITS1F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA，ITS2：GCTGCGTTCTTCATCGATGC（真菌）。第二輪擴增體系：2×HieffRRobust PCR Master Mix 15 μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，產物DNA 20 ng；加水至30 μL。第二輪擴增條件：95 ℃，3 min→（94 ℃，20 s→55 ℃，20 s→72 ℃，30 s）5個循環→72 ℃，5 min→10 ℃，∞。

1.3.5 DNA定量與上機測序

PCR產物利用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并通過Qubit3.0熒光定量儀對PCR產物進行定量。PCR產物由生工生物工程（上海）股份有限公司的Illumina Mieq測序平臺將進行測序。

1.3.6 數據處理與分析方法

將上機測序后的原始序列通過去除引物接頭、序列拼接、過濾、去除嵌合體以及非特異性擴增序列后得到各樣本的有效數據。將最終優化的有效數據按照序列間的距離進行聚類，并根據序列之間的相似性將序列分成不同的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），在97%相似度水平下進行OTU聚類分析。因酸菜樣本在提取基因組DNA時不可避免的會混入酸菜植物自身的基因組DNA，因此通過基因內轉錄間隔區（intergenic transcribed spacer，ITS）引物擴增后會產生植物序列。為避免植物ITS序列的干擾，測序結果去除了植物類的OTU后再進行后續分析。

Alpha多樣性分析：選取了OTU數、覆蓋率（Coverage）、香農（Shannon）指數、辛普森（Simpson）指數、超（Chao1）指數進行分析。其中覆蓋率（Coverage）代表文庫是測序深度指標；Chao1指數代表微生物總數指標，其數值越高表明微生物總量越大；微生物多樣性由Shannon、Simpson指數進行評估，Shannon指數與微生物多樣性呈正相關，Simpson指數與微生物多樣性呈負相關。

微生物分子生物學鑒定：細菌鑒定數據庫（核糖體數據庫項目（ribosomal database project，RDP）數據庫、Silva數據庫、美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）數據庫）；真菌鑒定數據庫（RDP數據庫、Unite數據庫）。

2 結果與分析

2.1 測序數據合理性分析

稀釋曲線（rarefaction curve）是采用對測序序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數與多樣性指數做曲線，主要用來判斷測序深度是否合理。當曲線趨向平坦時，說明測序數據量合理，反之則表明繼續測序還可能產生較多新的OTU，測序深度不夠。各樣品所獲得的有效擴增序列數分別為：細菌分類測序中T1：1 726條、T2：2 219條、T3：6 758條、T4：9 638條；真菌分類測序中T1：3 862條、T2：10 381條、T3：5 651條、T4：2 448條。由各抽取的序列數與Shannon指數構建的稀釋曲線見圖1。

圖1 酸菜樣品中細菌（A）和真菌（B）的Shannon指數稀疏曲線Fig. 1 Rarefaction curves of Shannon indexes of bacteria (A) and fungi (B) in sauerkraut samples

由圖1A可知，細菌分類測序中得到的有效序列數從樣品T1到T4逐漸增多，稀釋曲線均趨向平坦。由圖1B可知，真菌分類測序中得到的有效序列數從樣品T1到T3逐漸增多而樣品T4最少，稀釋曲線也均趨向平坦。結果表明，測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量新的OTU，測序結果可信度高。

2.2 Alpha多樣性分析

通過對4個酸菜樣品進行細菌和真菌兩方面的高通量測序分析，對分析結果的OTU數、Coverage、Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數進行Alpha多樣性分析，結果分別見表1和表2。

表1 酸菜樣品中細菌Alpha多樣性指數分析結果Table 1 Analysis results of Alpha diversity indexes of bacteria in sauerkraut samples

表2 酸菜樣品中真菌Alpha多樣性指數分析結果Table 2 Analysis results of Alpha diversity indexes of fungi in sauerkraut samples

由表1和表2可知，各酸菜樣品中細菌的OTU覆蓋率為86.9%～98.2%，真菌的OTU覆蓋率為98.2%～99.6%，表明樣品中的微生物種類的絕大部分都被檢測到。從體現微生物總量的Chao1指數上看，發酵末期（T4）細菌和真菌的總量均最少，推測由于發酵末期酸菜中各種有機酸的積累導致pH較低抑制微生物的生長有關。從與微生物群落多樣正相關的Shannon指數以及負相關的Simpson指數來看，隨著發酵時間的延長，細菌Shannon指數逐步減小，Simpson指數逐步增加，真菌Shannon指數除T2時期外也是逐步減小，Simpson指數逐步增加。說明酸菜中微生物群落多樣性呈下降趨勢，發酵末期的微生物群落多樣性最低；隨著發酵的進行微生物群落多樣性逐漸降低主要由于優勢發酵菌群的形成、營養物質的消耗、代謝產物的積累，從而抑制其他菌群的生長。

2.3 基于OTU豐度的樣本聚類分析

聚類樹圖可以通過樹枝結構直觀表示各個樣品間的相似性和差異關系，根據各樣本細菌和真菌OTU豐度計算樣本間多樣性距離矩陣，分別繪制樣本聚類樹圖，結果見圖2。

圖2 酸菜樣品中細菌（A）和真菌（B）樹狀聚類圖Fig. 2 Tree cluster diagram of bacteria (A) and fungi (B) in sauerkraut samples

由圖2可知，酸菜樣品中細菌聚類結果顯示樣品T1、T2相似性較高為一聚類，樣品T3、T4相似性較高為另一聚類。酸菜樣品中真菌聚類結果顯示樣品T3、T4相似性較高為一聚類，樣品T1和T2與其他樣品相似性都較低單獨聚類。從參與發酵的真菌和細菌兩個方面來看，酸菜發酵前期微生物群落結構隨著發酵的進行變化大，相似性較低；而酸菜發酵的后末期發酵微生物群落結構趨于穩定相似性較高。

2.4 發酵微生物組成分析

2.4.1 發酵微生物門屬個數分析

通過高通量測序分析四個不同發酵時期的晴隆酸菜，共鑒定出細菌24門262屬，真菌7門131屬。具體各發酵時期鑒定結果見表3。

表3 酸菜樣品中細菌和真菌門、屬個數Table 3 Number of phylum and genus of bacteria and fungi in sauerkraut samples

由表3可知，四個不同發酵時期的晴隆酸菜中微生物處于動態變化之中，隨著發酵的進行微生物種類也在進行著新增與消亡。從總體微生物門屬來看，發酵后期（T4）晴隆酸菜中所含有的微生物種屬門類最少。結果與Alpha 多樣性分析結果中發酵后期（T4）晴隆酸菜中微生物多樣性最低相一致。該現象的出現與發酵后期酸菜中營養物質的消耗，各種代謝產物的積累，pH值降低等因素相關。

2.4.2 發酵微生物屬層面韋恩圖

通過不同發酵時期所鑒定的所有微生物屬（細菌、真菌），分析各時期的獨有和共有屬，制作屬層面的韋恩圖，從而直觀的展現出各發酵時期的屬數目組成相似性及重疊情況，結果見圖3。

圖3 酸菜樣品中細菌（A）和真菌（B）屬水平韋恩圖Fig. 3 Venn of bacteria (A) and fungi (B) in sauerkraut samples based on genus level

由圖3可知，四個發酵時期共有細菌屬91個占總數的34.7%，共有真菌屬32個占總數的24.4%。四個發酵時期細菌特有菌屬個數分別為：T1為27個、T2為17個、T3為26個、T4為13個；四個發酵時期真菌特有菌屬個數分別為：T1為14個、T2為13個、T3為18個、T4為9個。發酵末期（T4）所含的特有微生物屬（細菌和真菌）是最少的，其結果與T4時期微生物多樣性最低、微生物種屬個數最少具有一定的相關性。

2.4.3 發酵微生物屬相對豐度分析

根據分子鑒定結果將樣本中的微生物以屬為最小分類單元進行相對豐度的統計，構建細菌和真菌屬水平相對豐度柱狀圖，其中不同顏色代表不同的微生物屬種類，柱狀的方塊的長短代表相對豐度的高低，結果見圖4。

圖4 酸菜樣品發酵過程中細菌（A）和真菌（B）基于屬水平的相對豐度Fig. 4 Relative abundance of bacteria (A) and fungi (B) in sauerkraut samples during fermentation based on genus level

由圖4A可知，從樣品T1到T4體現了自然發酵過程中隨著發酵的進行，細菌菌屬多樣性逐漸降低，逐漸出現優勢發酵菌屬的過程，發酵后末期魏斯氏菌（Weissella）相對豐度（67.68%）最高成為最主要的優勢菌。由圖4B可知，發酵真菌群落隨著發酵的進行，群落結構發生著動態的變化，種屬相對豐度也隨之變化。Sampaiozyma和枝孢菌（Cladosporium）兩個屬在發酵過程中一直占有較高的相對豐度（分別≥16.42%和≥11.23%），Plectosphaerella在發酵后期出現優勢（相對豐度為27.74%）。

2.4.4 優勢發酵微生物屬分析

通過屬水平上微生物分類，統計各微生物屬的相對豐度，根據相對豐度劃分出各發酵時期的優勢微生物（相對豐度＞5.0%），結果見表4。

由表4可知，發酵優勢細菌方面，各時期的優勢菌屬總數較少只有5個屬。鞘脂單胞菌（Sphingomonas）和根瘤菌（Rhizobium）兩個屬隨著發酵的進行，相對豐度逐步降低，分別由17.79%、9.21%降低至1.41%、0.34%；而魏斯氏菌（Weissella）則隨著發酵的進行，相對豐度逐步提高，由0.41%升高至67.68%，尤其是從發酵后期（T3）開始增速明顯；乳桿菌（Lactobacillus）同樣在發酵前中期（T1、T2）相對豐度較低，而到發酵末期（T4）最終達到17.9%。明串珠菌（Leuconostoc）則呈現先揚后抑的動態變化，從發酵前期（T1）0.41%迅速增長至發酵中期（T2）27.35%，而從發酵后期（T3）開始逐漸降低，到發酵末期（T4）降至5.5%。

表4 酸菜樣品發酵過程中優勢菌屬Table 4 Dominant genus in sauerkraut samples during fermentation

發酵優勢真菌屬方面，各時期的優勢菌屬總數較多有9個屬。相對豐度動態變化較為明顯的為Plectosphaerella和擲孢酵母（Sporobolomyces）。Plectosphaerella在發酵前中后期（T1、T2、T3）相對豐度均在2%左右，而在發酵末期（T4）相對豐度迅速增加至27.74%成為占比最大的優勢菌屬擲孢酵母（Sporobolomyces）則是在發酵前期（T1）和發酵后末期（T3、T4）相對豐度較低3%左右，而在發酵中期（T2）相對豐度則達到了較高的水平（22.08%）；Vishniacozyma在發酵前中期（T2、T3）兩個時期相對豐度增加明顯，最高達到7.51%，但T4期結束時降到了2.45%。其他優勢菌屬動態變化不大，相對豐度略有增減。

2.5 討論

晴隆酸菜成品（T4）所包含的三個優勢細菌屬分別為魏斯氏菌（Weissella）（67.68%）、乳酸桿菌（Lactobacillus）（17.9%）、明串珠菌屬（Leuconostoc）（5.5%）；四個優勢真菌屬分別為Sampaiozyma（24.8%）、枝孢菌（Cladosporium）（11.23%）、附球菌（Epicoccum）（6.62%）、Plectosphaerella（27.74%）。在真菌方面，Sampaiozyma可產淀粉酶、脂肪酶、植酸酶、幾丁質酶、菊粉酶等多種胞外酶[9]，可能參與酸菜發酵過程中生物大分子的降解。枝孢屬具有產木聚糖酶和纖維素酶功能[10-12]，可對酸菜中的纖維素進行分解。附球菌屬可利用自身分泌的抗菌物質抑制其他病原菌生長，其中抗霉菌效果顯著[13-14]，從而抑制酸菜中霉菌的生長。Plectosphaerella在食品方面未見研究報道。三個優勢細菌屬魏斯氏菌、乳酸桿菌、明串珠菌均屬于發酵食品中常見的乳桿菌目（Lactobacillales），而發酵成品（T4）中總的乳桿菌目（Lactobacillales）達到了91.17%。魏斯氏菌是食品發酵中一類重要的乳酸菌，存在于泡菜[15]、醬油[16]、白酒[17]、醬肉[18]等發酵食品中，在發酵食品中具有廣泛的應用價值。食品發酵過程中魏斯氏菌可以顯著增加食品中短鏈脂肪酸、有機酸、酯類等風味物質含量，提高發酵食品風味[19]。乳桿菌屬作為常見的食品發酵菌屬以及益生菌屬，廣泛運用于酸奶、益生菌制劑等方面。乳酸桿菌可以定植在機體消化系統內，提高消化系統菌群中乳酸菌的優勢，具有維持消化系統微生態系統的平衡、對消化系統進行功能改善、治療消化系統疾病等功能[20-21]。明串珠菌屬生存環境比較廣泛，植物表面和根部都有存在[22]，在韓國泡菜、中國酸菜、德國干酪等發酵食品中也屬于優勢菌種[23-24]。明串珠菌通過代謝除了產生乳酸、乙酸外還可以產生甘露醇、細菌素、胞外多糖、雙乙酰等代謝產物，使其在食品保健、醫藥衛生等領域具有廣闊前景。晴隆酸菜成品（T4）中所含的細菌超過90%均為常見的食品發酵菌屬，且具有提高發酵風味、具有益生菌功能等特點，為晴隆酸菜在營養價值與促進健康方面提供理論支撐。優勢發酵菌屬同時也抑制了其他雜菌的生長，維持了酸菜發酵菌群的穩定，為晴隆酸菜的微生物安全穩定提供一定的保障。

3 結論

本研究采用高通量測序的方法，對晴隆酸菜四個發酵時期（T1、T2、T3、T4）微生物多樣性、發酵微生物菌群動態變化、優勢菌群等方面進行了分析。通過與細菌真菌數據庫比對鑒定出細菌24門262屬，真菌7門131屬。通過Alpha多樣性分析以及具體微生物種屬組成的研究，結果表明晴隆酸菜中微生物群落多樣性隨著發酵的進行呈下降趨勢，發酵末期的微生物群落多樣性最低、微生物種屬數量最少。通過基于OTU的樣品聚類分析，晴隆酸菜發酵前中期微生物群落結構不穩定、相似性較低，而發酵后末期微生物群落結構穩定、相似性較高。四個發酵時期的酸菜中存在著優勢菌屬的消長變化，總發酵過程中優勢菌屬為細菌5個魏斯氏菌（Weissella）、乳酸桿菌（Lactobacillus）、明串珠菌（Leuconostoc）、鞘脂單胞菌（Sphingomonas）、根瘤菌（Rhizobium），真菌9個Sampaiozyma、枝孢菌（Cladosporium）、擲孢酵母（Sporobolomyces）、Vishniacozyma、附球菌（Epicoccum）、Plectosphaerella、Filobasidium、紅酵母（Rhodotorula）、枝頂孢（Acremonium）。發酵酸菜成品（T4）的三個優勢細菌屬分別為魏斯氏菌Weissella（67.68%）、乳酸桿菌Lactobacillus（17.9%）、明串珠菌Leuconostoc（5.5%）均屬于乳桿菌目（Lactobacillale），為食品發酵常見發酵菌屬。