高通量測序技術分析刺梨自然發酵過程中細菌多樣性

劉曉柱，張遠林，李銀鳳，于志海，劉曉輝，黃名正

（貴州理工學院 食品藥品制造工程學院，貴州 貴陽550000）

刺梨（Rosa roxburghii）是一種廣泛分布于我國西南地區的薔薇科、薔薇屬植物，具有豐富的營養價值和藥用價值[1-2]。但刺梨果實中酚類物質含量較高，鮮果生食口感酸澀，比較適宜進行精深加工，如發酵生產刺梨果酒、果醋等飲品[3-4]。不同種類微生物的代謝活動，均影響著釀造酒的質量[5]，這些微生物包括酵母菌、霉菌、細菌等[6-8]。研究表明，在果實的自然發酵過程中，除了酵母菌，醋酸桿菌屬（Acetobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、葡糖桿菌屬（Gluconobacter）等細菌也會對發酵過程產生重要影響。如乳酸菌的異常代謝，可產生多種揮發酸；醋酸菌的甘油代謝、糖代謝和酒精的醋化，都會引起葡萄酒的病害[9-12]；葡糖桿菌屬細菌可產生乙酸，影響葡萄酒的感官品質[13]。謝丹等[14]采用高通量測序技術分析了刺梨果渣自然發酵過程中細菌群落結構及多樣性。張源等[15]基于高通量測序分析了草莓酒發酵過程中的細菌群落特征，發現歐文氏菌屬（Erwinia）、檸檬酸菌屬（Citrobacter）、乳酸球菌屬（Lactococcus）、泛菌屬（Pantoea）以及未知屬細菌在草莓酒的發酵過程中動態變化，且與酒體特征相關。本研究采用高通量測序技術，解析刺梨自然發酵過程中細菌菌群多樣性及其動態變化，對優質刺梨釀造菌種的選育及控制發酵酒的品質具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

刺梨（Rosa roxburghii），品種為貴龍5號，采購于2019年9月份貴州龍里地區，平均單果質量（22.26±0.82）g，糖度（9.89±0.23）°Bx，pH值為3.58±0.11。

1.1.2 化學試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒：美國MP Biomedicals公司；Pfu高保真DNA聚合酶（100 U/管）：北京TransGen Biotech有限公司；瓊脂糖凝膠：西班牙Biowest公司；DNA Marker：生工生物工程（上海）股份有限公司；引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）、806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）：上海美吉生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設備

N13462C移液器、5430 R小型離心機：德國Eppendorf公司；ABSON MiFly-6微型離心機：合肥艾本森科學儀器有限公司；NanoDrop2000超微量分光光度計：美國Thermo Fisher Scientific公司；GeneAmpR9700聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；Illumina Miseq測序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 刺梨自然發酵

取新鮮、成熟、無霉爛的貴農5號刺梨，用無菌水沖洗果實表面泥沙，切碎，置于無菌1 L三角瓶中。28 ℃進行靜置自然發酵，在自然發酵的1 d、3 d、5 d、15 d分別取樣1 mL，命名為F1、F3、F5、F15，每個樣本3個平行重復，保存于-80 ℃冰箱用于高通量測序。

1.3.2 高通量測序與生物信息學分析[16-18]

按照試劑盒說明書提取刺梨自然發酵液中細胞基因組脫氧核糖核酸（DNA），利用NanoDrop2000進行DNA純度與濃度檢測，瓊脂糖凝膠電泳進行DNA完整性檢測。取適量的DNA模板，以338F和806R為引物進行PCR擴增，擴增細菌16S rRNA基因，PCR擴增體系為5×FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L脫氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphos phate，dNTPs）2 μL，5 μmol/L 338F引物0.8 μL，5 μmol/L 806R引物0.8 μL，FastPfu聚合酶0.4 μL，DNA模板10 ng，補水至20 μL。PCR擴增條件為：95 ℃、3 min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、45 s，共30個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠檢測后，進行回收和純化。文庫的構建與Miseq測序由深圳微生太科技有限公司完成。

Miseq測序得到的序列，在深圳微生太平臺上進行數據的生物信息學分析。首先，根據取樣的時間和方式，把測序數據的樣本分為自然發酵1 d樣本（F1）、自然發酵3 d樣本（F3）、自然發酵5 d樣本（F5）和自然發酵15 d樣本（F15）共4組，每組3個平行重復。然后，按照相似度為97%，按照最小樣本序列數抽評樣本序列，運用QIIME2 dada2插件對測序原始數據進行質量控制，修剪，去噪，拼接及去除嵌合體。運用QIIME2 feature-classifier插件將代表序列與GREENGENES數據庫進行比對，獲得物種分類信息表。采用QIIME2 core-diversity插件計算Alpha多樣性指數。采用PCoA和NMDS圖展示Beta多樣性指數。基于樣本中主要微生物物種相對豐度分析，采用共現網絡分析（co-occurrence analysis）計算斯皮爾曼等級相關系數，從而了解物種之間的關聯。PICRUSt軟件預測微生物群體可能的功能組成[19-20]。

2 結果與分析

2.1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定

刺梨自然發酵不同階段的樣品中細菌16S rRNA PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。由圖1可知，刺梨自然發酵4個階段（F1、F3、F5和F15）12個樣本的PCR擴增產物條帶特異性和亮度均較好，可滿足下一步的測序需求。

圖1 刺梨自然發酵液樣品中細菌群落16S rDNA PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR amplified product of bacterial community in nature fermentation liquid samples of Rosa roxburghii

2.2 測序樣本數據分析

刺梨自然發酵液4個階段的樣本，經過測序樣本數據分析，結果見表1。由表1可知，共得到230 692條讀數，經質量控制（過濾、去噪、去嵌合體）后共得到150 385條有效序列，序列的平均堿基長度約500 bp。

表1 刺梨自然發酵液樣品測序樣本讀數結果Table 1 Results of sequencing sample reads of nature fermentation liquid samples of Rosa roxburghii

2.3 Alpha多樣性分析

稀釋曲線可用于驗證測序數據量是否滿足反映樣品中物種多樣性的需求，刺梨自然發酵液樣品的稀釋曲線見圖2。由圖2可知，刺梨自然發酵液4個樣品細菌操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）圖平緩性較好，能夠反映樣本中絕大部分細菌菌落特征和多樣性信息。稀釋曲線還可以間接反映樣品中物種的豐富度，結果表明，F1樣品中細菌多樣性最大，4個樣品中細菌豐富度程度大小為F1＞F15＞F3＞F5。

圖2 刺梨自然發酵液樣品稀釋曲線Fig. 2 Dilution curve of nature fermentation liquid samples of Rosa roxburghii

Shannon指數可綜合衡量樣本中的物種多樣性，通常Shannon指數數值越大，表示樣本中物種的多樣性越高，反之，則樣本中物種多樣性越低。刺梨自然發酵樣品Alpha多樣性指數指數結果見表2。

表2 刺梨自然發酵液樣品Alpha多樣性指數Table 2 Alpha diversity indexes of nature fermentation liquid samples of Rosa roxburghii

由表2可知，樣品F1的Shannon指數和OTU數均最大，說明樣本F1中物種多樣性最豐富。比較4個樣本的Shannon指數和OTU數可以發現，隨著刺梨自然發酵的進行，樣品中細菌多樣性表現出先逐漸降低，再增加的趨勢。Ace指數和Chao1指數也可用來衡量樣本中的物種的種類。Ace指數和Chao1指數越大，則樣本中物種種類越多。由表2可知，在刺梨自然發酵樣本中，樣本F1的Ace指數和Chao指數均最大。

2.4 物種組成

基于OTU的絕對豐度及注釋信息，對每個樣品在界、門、綱、目、科、屬、種7個分類水平上的序列數目占總序列數的比例進行統計，可以有效的評估樣本的物種注釋分辨率。每個樣本中OTU在各分類水平注釋的相對程度結果見圖3。刺梨發酵液各樣本細菌菌群屬水平分布Venn圖見圖4，屬水平細菌菌群相對豐度見圖5。

由圖3可知，在門水平上，刺梨自然發酵過程中共檢測到變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、藍細菌門（Cyanobacteria）等8個門的細菌類，優勢細菌門為Proteobacteria，占98.66%；在刺梨自然發酵的前期，包括樣品F1、F3和F5中基本上未檢測到厚壁菌門（Firmicutes）菌群，但在發酵后期的樣品F15中，厚壁菌門（Firmicutes）的比例達到5.26%，暗示其在刺梨自然發酵的后期發揮作用。

圖3 刺梨自然發酵液樣品序列注釋程度Fig. 3 Sequence annotation degree of nature fermentation liquid samples of Rosa roxburghii

圖4 刺梨自然發酵液各樣本細菌菌群屬水平分布Venn圖Fig. 4 Venn diagram of bacteria community distribution at the genus level of nature fermentation liquid samples of Rosa roxburghii

圖5 刺梨自然發酵液各樣本屬水平細菌菌群相對豐度Fig. 5 Relative abundance of bacteria community of nature fermentation liquid samples of Rosa roxburghii at the genus level

由圖4可知，在屬水平，樣品F1特有屬40種，樣品F3特有屬6種、樣品F5特有屬5種，樣品F15特有屬11種；4個樣本共有屬14種。

由圖5可知，隨著刺梨發酵的不斷進行，葡糖桿菌屬細菌（Gluconobacter）表現出先增加后降低的趨勢；弗拉托氏菌屬（Frateuria）、腸桿菌屬（Enterobacteriaceae）、塔特姆菌屬（Tatumella）在刺梨發酵過程中含量逐漸降低；而醋酸桿菌屬（Acetobacter）和葡糖醋桿菌屬（Gluconacetobacter）、酒酒球菌屬（Oenococcus）細菌含量在發酵過程中含量不斷增加。表明隨著刺梨自然發酵的不斷進行，參與糖代謝相關菌群量逐漸降低，而參與酒精發酵、乳酸發酵以及醋酸發酵相關菌群量逐漸增加。

2.5 樣本比較分析

LEfSe法是非參數檢驗和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）的結合，適合菌群豐度差異檢驗。由圖6可知，在刺梨自然發酵的樣品F1中，菌群總體豐度較高，且甲基桿菌屬（Methylobacterium）、弗拉托氏菌屬（Frateuria）、痰塔特姆氏菌（Tatumella）、拉恩氏菌屬（Rahnella）、黃單胞菌屬（Xanthomonadaceae）、腸桿菌屬（Enterobacter）等菌屬在樣品F1中分布較為特異性；在發酵終點樣品F15中，醋酸桿菌屬（Acetobacter）菌群豐度較高，較為特異性。

圖6 刺梨自然發酵液樣品細菌菌群LEfSe法線性判別分析Fig. 6 Linear discriminant analysis of bacteria community of nature fermentation liquid samples of Rosa roxburghii by LEfSe method

2.6 功能分析

基于KEGG功能注釋的方法分析刺梨自然發酵過程中各菌群的功能特性，結果見圖7。由圖7可知，在發酵過程中，菌群中與細胞處理（Cellular Processes）相關過程和環境信息處理（Environmental Information Processing）過程逐漸降低；而與代謝（Metabolism）相關、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）過程逐漸增加。

圖7 刺梨自然發酵液樣本菌群功能分析Fig. 7 Functional analysis of bacteria community of nature fermentation liquid samples of Rosa roxburghii

3 結論

本研究基于高通量測序技術的研究結果表明，在刺梨發酵的起始階段微生物多樣性最高，隨著刺梨果實發酵的不斷進行，葡糖桿菌屬細菌（Gluconobacter）表現出先增加后降低的趨勢；弗拉托氏菌屬（Frateuria）、腸桿菌屬（Enterobacteriaceae）、塔特姆菌屬（Tatumella）細菌在刺梨發酵過程中含量逐漸降低；而醋酸桿菌屬（Acetobacter）和葡糖醋桿菌屬（Gluconacetobacter）、酒酒球菌屬（Oenococcus）細菌含量在發酵過程中含量不斷增加。通過高通量技術較為全面的掌握了刺梨自然發酵過程中細菌多樣性及其菌群結構變化，為后續進行優質刺梨釀造菌種的選育奠定了基礎。