超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定環境水體中3種典型“三高”藥物殘留

陳澤雄 周志洪 巫陪山 馬艷芳

(1.廣州市環境監測中心站，廣州，510030；2.廣東省科學院，中國廣州分析測試中心，廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣州，510070)

近年來，隨著生活水平的提高，我國居民慢性疾病高血壓、高血糖、高血脂(俗稱“三高”)的發病率也呈增長趨勢。最新的《中國心血管病報告2018》顯示，中國成人高血壓、血脂異常和糖尿病標化患病率分別為27.9%、40.4%和10.9%；治療率分別為45.8%、19.5%和32.2%[1]。這3種疾病構成了代謝綜合征的主體，其患病率隨著患者年齡增長而升高[2]。“三高”人群往往需要根據自身病情，選用合適的藥物，并長期服用以維持病情穩定，其中，硝苯地平、格列吡嗪和吉非羅齊作為降壓藥、降糖藥和降脂藥使用廣泛[3,4]。藥物使用以后不能完全被人體吸收，一部分隨患者排泄物進入污水處理系統，從而進入環境水體[5]，并對各級水生生物造成生物毒性效應[6]。研究表明，硝苯地平(10 μM)可誘導歐洲湖蛙(Pelophylax ridibundus)體內氧自由基產生，增加谷胱甘肽和氧化谷胱甘肽濃度，并導致超氧化歧化酶活性升高[7]；吉非羅齊對大型蚤(Daphnia magna)的無效應觀察濃度為30 μM[8]，環境相關濃度的吉非羅齊(1.5 μg/L)能對鯛魚(Sparus aurata)造成明顯的基因損傷[9]。

環境水體來源廣泛，組成復雜，包含多種藥物活性物質，前期研究表明，環境水體中的多種藥物活性成分協同作用下，往往對水生生物存在更強的毒性效應[10,11]。前期有學者分別調查了硝苯地平、格列吡嗪和吉非羅齊在環境水體中的含量，結果表明，硝苯地平在地表水和污水處理廠污水中均有檢出[12,13]；格列吡嗪在中國膠州灣海水中廣泛檢出，檢出率達58%[14]；吉非羅齊在地表水、污水處理廠污水中均廣泛檢出，含量可達45.2 μg/L[15-17]。然而，同時監測環境水體中3種典型“三高”藥物硝苯地平、格列吡嗪和吉非羅齊含量的研究鮮有報道。“三高”癥狀人群需要長期同時服用降壓藥、降糖藥和降脂藥以控制病情，其中，一部分未被患者完全吸收代謝的藥物能夠隨生活污水持續排入環境中。此外，藥物代謝物的轉化產物以及制藥廠出水中未處理完全的藥物均可通過城市污水管網進入受納環境。由于環境水體中藥物殘留來源廣泛，并對生態環境造成持續影響。因此，有必要開發靈敏、可靠的分析方法，用于同步篩查環境水體中典型“三高”藥物硝苯地平、格列吡嗪和吉非羅齊的含量，為評估其環境生態風險提供方法保證。

1 實驗方法

1.1 儀器、試劑與材料

安捷倫1290系列超高效液相色譜-6470系列三重四級桿串聯質譜聯用儀(UPLC-MS/MS，美國，Agilent)；EFAA-DC24-RT系列24孔平行氮吹儀(中國，安譜)；SBEQ-CG1824系列固相萃取裝置(中國，安譜)。

ENVI-Carb固相萃取柱(500 mg，6 mL)、MCX固相萃取柱(500 mg，6 mL)、MAX固相萃取柱(500 mg，6 mL)、HLB固相萃取柱(500 mg，6 mL)購自美國Waters公司；GF/F玻璃纖維濾膜(0.7 μm)購自英國Whatman公司；有機相濾頭購自中國安譜公司。

硝苯地平標準品購自加拿大TRC公司；格列吡嗪標準品購自中國源葉公司；吉非羅齊標準品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；同位素標記標準品奈韋拉平-d3、苯扎貝特-d4、吉非羅齊-d6購自加拿大TRC公司，其純度均高于95%。色譜純乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、正己烷購自德國Merk公司；色譜純乙酸銨、甲酸購自德國CNW公司；分析純硫酸、氨水購自中國科密歐公司；實驗用水為屈臣氏蒸餾水。所有標準品均采用甲醇配制成100 mg/L的標準儲備溶液，通過逐級稀釋標準儲備溶液獲得不同濃度的標準工作溶液，標準儲備溶液及標準工作溶液均置于-20 ℃避光保存。

1.2 樣品采集

地表水樣品從流溪河水庫采集，流溪河水庫位于廣州市從化區東北部(23°45′N，113°46′E)，水庫水面面積約為13 km2，整個流域水土狀況保持良好，人類活動影響小。污水處理廠樣品從廣州市南沙污水廠采集，南沙污水廠服務人口30萬，日進水量約8萬噸。地表水和污水處理廠污水均采用1 L棕色玻璃瓶采集，樣品采集后立即加入50 mL甲醇抑制微生物活動，采用冷藏恒溫箱盡快運回實驗室，并于48 h內完成樣品前處理。

1.3 樣品前處理

采用GF/F玻璃纖維濾膜(0.7 μm)過濾以去除水樣中的懸浮顆粒物，然后向水樣中加入100 ng(1 mg/L，100 μL)的混合同位素標記標準品作為內標，并混合均勻。采用HLB固相萃取柱(500 mg，6 mL)，通過固相萃取法提取3種目標藥物。首先，依次采用10 mL甲醇、10 mL超純水活化HLB小柱，隨后以5～10 mL/min的流速加載水樣，并始終保持液面高于HLB小柱填料表面。樣品加載完畢后，用20 mL甲醇/水溶液(v/v=5∶95)潤洗樣品瓶2次，并過柱。

抽真空2 h以去除小柱中殘留的水分。小柱干燥后，分別用4 mL甲醇、3 mL二氯甲烷和3 mL乙酸乙酯洗脫富集在小柱填料上的目標藥物，收集洗脫液，采用氮氣緩慢地將洗脫液濃縮至近干，用1 mL甲醇定容濃縮液，并轉移到1 mL棕色進樣小瓶，置于-20 ℃冰箱避光保存用于后續分析。分析前，取100 μL待測樣品溶液，用氮氣緩慢濃縮至近干，用含5 mmol/L乙酸銨的甲酸(體積分數0.2%)水溶液與甲醇的混合溶液(v/v=1∶4)重新溶解，定容至100 μL，待測。

1.4 儀器分析

樣品提取液采用UPLC-MS/MS進行分析，色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)，色譜柱前端接0.22 μm在線過濾器，用于去除流動相和樣品中的微小顆粒物。色譜分離后，樣品通過電噴霧離子源(ESI)霧化，隨后進入質譜檢測器，進樣量為2 μL。目標藥物均在多重反應模式(MRM)下進行分析。

硝苯地平和格列吡嗪采用ESI+模式監測，柱溫箱溫度為40 ℃；流動相為緩沖溶液A(含5 mmol/L乙酸銨和0.2%甲酸的水溶液)和B甲醇，流動相流速為0.3 mL/min，總運行時間6.5 min；梯度洗脫程序為：0 min，20% B；0.5 min，25% B；1.5 min，35% B；2.5 min，45% B；3 min，55% B；6.5 min，85% B。干燥氣流速為8 L/min，溫度為350℃；霧化器壓力為45 psi；鞘氣溫度為350 ℃，流速為12 L/min；噴嘴電壓為500 V；毛細管電壓為3500 V。

吉非羅齊采用ESI-模式監測，柱溫箱溫度為35 ℃；流動相為A純水溶液和B甲醇，流動相流速為0.32 mL/min，總運行時間5 min。梯度洗脫程序為：0 min，10% B；1.5 min，55% B；2.5 min，70% B；3.8 min，88% B；4.8 min，93% B；5 min，97% B。干燥氣流速為11 L/min，溫度為280 ℃；霧化器壓力為50 psi；鞘氣溫度為350 ℃，流速為11 L/min；噴嘴電壓為2000 V；毛細管電壓為3500 V。3種目標藥物的UPLC-MS/MS分析參數如表1所示。

表1 3種目標藥物的超高效液相色譜-質譜分析參數

2 結果與討論

2.1 前處理方法優化

2.1.1固相萃取柱選擇

為了獲得最佳的富集和凈化效果，需要根據目標化合物性質選擇合適的固相萃取小柱類型。本研究考察了4種不同填料的固相萃取小柱對3種目標藥物回收率的影響：a)石墨化炭黑吸附柱ENVI-Carb；b)陽離子交換柱MCX；c)陰離子交換柱MAX；d)聚合物反相柱HLB。其中，ENVI-Carb柱無鍵合相，常用于極性和非極性化合物的吸附萃取[18]；MCX柱是弱陽離子交換柱，常用于提取弱堿性化合物[19]；MAX柱是弱陰離子交換柱，常用于提取弱酸性化合物[20]；HLB柱由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮聚合而成，對酸堿性和極性不同的化合物均有較好的提取效果[19]。4種不同填料固相萃取小柱對目標藥物的提取效率如圖1所示，3種目標藥物在ENVI-Carb柱、MCX柱、MAX柱和HLB柱中的加標回收率范圍分別為2%～153%、76%～122%、75%～165%和91%～133%。總體而言，MCX柱和HLB柱對3種目標藥物均表現出較好的提取效果。硝苯地平在ENVI-Carb柱中的保留效果很差，其加標回收率低至2%。格列吡嗪在ENVI-Carb柱和MAX柱中的加標回收率均高于120%，這與其內標化合物Benzafibrate-d4的提取效率偏低有關。由于MCX柱的價格較昂貴，綜合考慮目標化合物提取效率和固相萃取小柱價格因素，最終選擇采用HLB柱提取目標藥物。

圖1 不同固相萃取小柱對3種目標藥物回收率的影響

2.1.2樣品pH條件選擇

樣品pH條件能夠影響化合物在水中的存在形態，從而影響化合物的萃取效率[21]。通過調研文獻可知，3種目標藥物硝苯地平、格列吡嗪和吉非羅齊的酸解離常數(pKa值)分別為3.93、5.2和4.75[22-24]。采集的環境水體樣品pH值為6.8，本實驗通過向樣品中分別加入硫酸溶液(4 mol/L)和氨水溶液(5%)調節樣品pH值，研究了酸性(pH=3)、中性(pH=6.8)和堿性(pH=10)條件下，HLB柱對目標藥物的提取效率(圖2)。如圖所示，酸性(pH=3)、中性(pH=6.8)和堿性(pH=10)條件下，3種目標藥物的加標回收率范圍分別為88%～191%、84%～128%和79%～124%。總體而言，中性條件(pH=6.8)和堿性條件(pH=10)下，HLB柱對3種目標藥物均表現出較好的萃取效果；酸性條件(pH=3)下，由于格列吡嗪的內標化合物Benzafibrate-d4回收率較低，導致格列吡嗪的回收率過高。由結果可知，相比保持樣品中性pH條件，將樣品pH值調為堿性對3種目標藥物的回收率沒有明顯提高，為了減少實驗操作步驟，最終選擇中性條件(pH=6.8)下萃取目標藥物。

圖2 不同pH值對3種目標藥物回收率的影響

2.1.3洗脫溶劑選擇

硝苯地平、格列吡嗪和吉非羅齊在固相萃取過程中的洗脫溶劑一般為甲醇和乙腈[25-27]，本研究考察了不同極性有機溶劑乙腈、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和正己烷對目標藥物的洗脫效果，結果如圖3所示。由圖可知，4種不同溶劑洗脫條件下，目標藥物均具有較好的洗脫效果，其加標回收率范圍分別為79%～113%、78%～113%、75%～115%和79%～110%，說明洗脫溶劑極性對3種目標藥物的洗脫效果影響較小。最終，選擇逐步加入甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯洗脫目標藥物。

圖3 不同提取溶劑對3種目標藥物回收率的影響

2.2 方法驗證

2.2.1加標回收率及相對標準偏差

采用優化后的提取方法，分別向流溪河水庫的地表水樣品和南沙污水處理廠的污水樣品中加入低、中、高3個濃度的標準溶液，每個濃度平行測定3次，對優化后的方法進行評價。結果如表2所示.加標濃度為5 ng/L、20 ng/L和200 ng/L的地表水樣品中，硝苯地平、格列吡嗪和吉非羅齊的回收率范圍分別為95%～103%、111%～126%和91%～98%，平行樣相對標準偏差(RSD)范圍為1%～26%；加標濃度為100 ng/L、500 ng/L和1000 ng/L的污水樣品中，硝苯地平、格列吡嗪和吉非羅齊的回收率范圍分別為71%～80%、87%～113%和105%～112%，RSD范圍為1%～28%。總體而言，目標藥物在不同加標濃度的樣品基質中回收率均在70%～130%范圍，RSD均<30%，所建立的方法能滿足環境樣品中3種目標藥物的分析要求。

表2 3種目標藥物的加標回收率和相對標準偏差(RSD)(n=3)

2.2.2線性范圍、基質效應及定量下限

采用優化后的提取方法分別提取流溪河水庫地表水樣品和南沙污水處理廠污水樣品，獲得2種樣品基質提取液，分別向2種基質提取液和空白甲醇/水(含5 mmol/L乙酸銨和0.2%甲酸)(v/v=1∶4)溶液中加入3種目標藥物的混合標準溶液，獲得系列濃度分別為2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、500 μg/L和2000 μg/L的混合基質標準曲線和空白標準曲線(內標濃度均為100 μg/L)。系列曲線溶液在選定的色譜分離和質譜檢測參數下，采用UPLC-MS/MS進行檢測，使用分析儀器匹配的MassHunter軟件進行分析，以目標藥物的歸一化相對響應值(Y)為縱坐標，歸一化相對濃度(X)為橫坐標，得到3種目標藥物的線性方程及相關系數(表3)。由表可知，在環境基質樣品提取液及空白溶液中，3種目標藥物在2 μg/L～2000 μg/L的濃度范圍內均具有良好的線性關系，線性相關系數r2為0.9989～0.9999。

表3 3種目標藥物在不同標準溶液曲線中的線性方程和相關系數

根據基質標準曲線和空白標準曲線的線性方程斜率，可進一步計算目標藥物在地表水和污水樣品中的基質效應，計算公式為[28]：

其中，α值為基質效應(%)；Smatrix為基質標準曲線線性方程斜率；Sblank為空白標準曲線線性方程斜率，α>0，說明存在基質增強效應；α<0，說明存在基質抑制效應；α絕對值越大，說明基質效應越明顯[28, 29]。如表4所示，硝苯地平和吉非羅齊在地表水和污水處理廠污水中主要存在基質抑制效應，格列吡嗪在地表水和污水處理廠污水中主要存在基質增強效應。總體上，3種目標藥物在水庫地表水和污水處理廠污水中的基質效應在±20%范圍內，其基質效應范圍分別為-3.2%～13%和-14%～19%。相比水庫地表水，目標藥物在污水處理廠樣品中受基質效應影響更大，這可能與污水處理廠污水成分復雜有關[30]。

向水庫地表水和污水處理廠污水樣品中分別添加目標物濃度為5 ng/L和100 ng/L的混合標準溶液，按照色譜峰高信噪比大于3(S/N>3)計算獲得物質檢出限(MDLs)，按照色譜峰高信噪比大于10(S/N>10)計算獲得物質檢測限(MQLs)。如表4所示，水庫地表水中3種目標藥物的MDLs范圍為0.04ng/L～0.24ng/L，MQLs范圍為0.13ng/L～0.79 ng/L；污水處理廠污水中3種目標藥物的MDLs范圍為1.00 ng/L ～1.89 ng/L，MQLs范圍為3.35ng/L ～6.32ng/L，相比地表水，污水來源廣泛，成分復雜，目標物在污水中的檢測限較高。總體上，3種目標藥物在地表水的MQLs均<1 ng/L，其中，硝苯地平的MQLs低于Varga等人報道的15 ng/L[31]；吉非羅齊的MQLs與Tran等人報道的0.4 ng/L相當[32]。3種目標藥物在污水處理廠污水中MQLs均<10 ng/L。硝苯地平的MQLs低于王釗等人報道的107 μg/L[25]；吉非羅齊的MQLs低于Abou-Elwafa Abdallah和王釗等人報道的14.5 ng/L和52.7 μg/L[25, 33]。

表4 3種目標藥物在環境樣品中的基質效應，檢出限及檢測限

2.3 方法應用

采用本實驗建立的提取-分析方法，對來源于流溪河水庫的地表水和南沙污水處理廠的污水進行檢測，每種環境樣品做3個份平行樣。結果顯示，目標藥物硝苯地平、格列吡嗪和吉非羅齊在3份地表水平行樣中均未檢出，說明該水庫受人類活動影響較小；硝苯地平在3份污水平行樣中均有檢出，其平均濃度為8.7 ng/L；格列吡嗪和吉非羅齊在污水中未檢出，這可能與硝苯地平作為降血壓藥使用量較大有關。

3 結論

建立了環境水體中典型“三高”藥物硝苯地平、格列吡嗪和吉非羅齊的提取、分析方法，通過探討固相萃取條件對“三高”藥物提取效率的影響，優化了提取方法，并對方法準確度、靈敏度及基質效應進行了驗證。所開發的方法用于檢測環境水體中典型“三高”藥物硝苯地平、格列吡嗪和吉非羅齊具有良好的回收率(70%～130%)、較弱的基質效應(±20%)和較低的檢測限(<10 ng/L)。本方法靈敏可靠，可同時篩查和檢測環境水體中痕量的典型“三高”藥物。