??????湘南臍橙柑橘黃龍病的PCR檢測及內生細菌的分離

雷平 黃彬彬 黃軍 畢世宇 郭照輝 劉清術 唐瀅

摘 要：為確保湘南臍橙產業發展安全，嚴格防控柑橘黃龍病，從湘南地區幾個臍橙種植園采集柑橘黃龍病疑似病株樣品和健康植株樣品，利用文獻報道的柑橘黃龍病PCR檢測常用引物對樣品進行分子檢測，并從病株組織中分離內生細菌進行分析鑒定。結果表明：在柑橘黃龍病的常規PCR檢測中，湘南臍橙總核酸對P400引物的靈敏度最高，是湘南地區臍橙中柑橘黃龍病害常規PCR檢測的最佳引物，其次為P535引物，而OI和16S這2對引物的靈敏度較低;對臍橙中柑橘黃龍病病株組織內生細菌的分離鑒定發現，柑橘中可培養內生細菌主要歸類為7個屬，分別為短桿菌屬（Curtobacterium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、異常球菌屬（Deinococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、微桿菌屬（Microbacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）;其中，LB和1/10LB培養基中的優勢菌屬為短桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和芽孢桿菌屬;而臍橙樹葉汁培養基中的優勢菌屬為短桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和微桿菌屬。

關鍵詞：臍橙;柑橘黃龍病;PCR檢測;內生細菌;湘南

中圖分類號：S432.42文獻標識碼：A文章編號：1006-060X（2020）07-0001-04

Abstract： In order to ensure the industry security of navel orange （Citrus sinensis Osb. var. brasliliensis Tanaka） in South Hunan and keep strict prevention or control of citrus Huanglongbing （HLB）， the diseased and healthy samples were collected from 4 navel orange ochards of Yizhang County， Chenzhou City， Hunan Province for the PCR detection of citrus HLB pathogen and the isolation of endogenous? bacteria. 4 kinds of PCR primers were used. In the routine PCR detection of citrus HLB， total nucleic acid of citrus HLB pathogen in the navel orange leaves has the highest sensitivity to primer P400 which is the optimal for PCR detection of citrus HLB for southern Hunan navel orange， followed by primer P535， while OI and 16S primers have lower sensitivity. Curtobacterium， Sphingomonas， Deinococcus， Pseudomonas， Methylobacterium， Microbacterium and Bacillus are seven species of culturable endogenous bacteria isolated from diseased samples. Curtobacterium， Sphingomonas and Bacillus are the dominant genera isolated with LB and 1/10LB， while Curtobacterium， Sphingomonas and Microbacterium are the dominant genera isolated with navel orange leaf juice + agar.

Key words： navel orange （Citrus sinensis Osb. var. brasliliensis Tanaka）; citrus Huanglongbing （HLB）; PCR detection; endogenous? bacteria; South Hunan

湘南地處我國三大柑橘產業帶（贛南—湘南—桂北），具有獨特的氣候、資源、區位、交通和人才優勢。湘南臍橙種植面積已遠超1.8萬hm2（該面積為《宜章縣產業發展規劃（2002—2010）》和《宜章縣產業發展規劃（2012—2017）》中規劃的臍橙發展面積），成為了當地經濟的支柱產業，特別是郴州的“宜章臍橙”已注冊成地理商標，具有較大的發展前景[1]。但隨著氣候的變暖，湘南臍橙受到了從華南地區向北擴散的柑橘黃龍病的影響，部分果園頻繁出現果樹葉片斑駁黃化，甚至果樹枯死和毀園的現象。因此，加強臍橙的檢疫與防治工作，對于湘南臍橙產業乃至湘南和湖南柑橘產業的發展有著重大的現實意義。

自20世紀初柑橘黃龍病首次在我國發現以來，先后在廣東、廣西、福建、臺灣等地區發生，且為害較為嚴重。雖然云南、貴州、浙江、四川、湖南等地也有發現，但屬零星分布，主要是苗木運輸所致，加強苗木監控即可有效遏制病情發生。然而，由于近年來全球氣溫持續變暖，柑橘木虱活動范圍不斷北擴，柑橘黃龍病的發生有逐漸向北擴散的趨勢，湘南地區由于臨近廣東、廣西等柑橘黃龍病高發區，故首當其沖地遭受柑橘黃龍病的為害。Gao等[2]的血清學試驗和Bastianel等[3]基于OMP基因的酶切分型試驗都表明柑橘黃龍病病原亞洲種具有較大的分化。董俊[4]的研究表明，華南地區的柑橘黃龍病病原存在著多種亞種的分化，并且其遺傳分化的規律主要取決于地域的分布和寄主植物品種的差異。雖然近年來有一些針對湖南地區的柑橘黃龍病的分子檢測研究[5-6]，但是關于湘南柑橘，特別是湘南臍橙柑橘黃龍病PCR檢測引物及病原伴生菌的研究尚未見報道。因此，筆者通過常規技術以多組柑橘黃龍病PCR檢測引物對湘南臍橙主產區——宜章的臍橙黃龍病株進行檢測鑒定，以期篩選出對湘南臍橙具有高特異性、高靈敏度的柑橘黃龍病PCR檢測引物，并從陽性病株中分離出一些柑橘黃龍病病原的伴生菌，為湘南地區臍橙柑橘黃龍病的診斷及防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 采 樣

臍橙枝葉樣品采自湖南省郴州市宜章縣4個不同的臍橙種植園（圖 1）。采樣植株為 6～10年生臍橙，主要采集1～3年生葉片，圖1中1～3號均為柑橘黃龍病株陽性樣品且病害程度遞增，4號樣品為柑橘黃龍病株陰性樣品。所有樣品均由宜章縣農業局植保站提供。采樣時間為2018年6月上旬，樣品采摘后帶回室內4℃保存，3 d內進行檢測和分離培養。

1.2 臍橙柑橘黃龍病的PCR檢測

參考高玉霞等[7]的方法提取植物葉片總核酸，略作調整?；静襟E：葉片清洗干凈并涼干后，切取葉片0.5 g，置于干凈的研缽中，用液氮快速研磨成粉末狀;收集到1.5 mL無菌離心管中，加入500 μL TES緩沖液（0.1 mol/L Tris-HCl，pH值8.0;2 mmol/EDTA，pH值8.0;2% SDS）漩渦混勻;加入500 μL酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1的混合液;漩渦5 min混勻;室溫12 000 r/min離心5 min，吸取上清液用1 mL無水乙醇和100 μL的NaAc混勻，-20℃ 5 min沉淀;室溫12 000 r/min離心3 min去掉上清液，然后用500 μL 75%乙醇清洗2次;室溫12 000 r/min離心3 min，沉淀在常溫下風干，加入100 μL無菌水溶解，即為總核酸樣品，-20℃保存。

PCR引物：根據相關文獻報道，選取16S引物對[7]、P400引物對[8]、P535引物對[9]、OI引物對[10]進行臍橙柑橘黃龍病檢測，引物序列見表1，由湖南擎科生物有限公司合成。

PCR檢測體系：2×PCR Mix buffer 25 μL，10 μmol/L引物各2 μL，模板1 μL，添加雙蒸H2O至50 μL。所有試劑均為寶生物工程（大連）有限公司TAKARA系列產品。

16S引物PCR擴增程序：94℃ 5 min→94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循環30 次→72℃10 min→4℃保存。P400引物PCR擴增程序：94℃5 min→94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，循環30次→72℃ 10 min→4℃保存。P535引物PCR擴增程序：94℃ 5 min→94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循環32次→72℃ 10 min→4℃保存。OI引物PCR擴增程序：94℃?5 min→94℃ 30 s，61℃ 1 min，72℃ 1.5 min，循環32次→72℃ 10 min→4℃保存。

1.3 臍橙柑橘黃龍病株內生細菌的分離鑒定

內生菌的分離參考王真真等[11]的方法，進行細微的調整。將采摘的1～3號臍橙樣品的葉片和枝條剪下用清水洗凈泥沙，置于超凈工作臺中吹干;放入磷酸氫二鈉溶液中超聲1 min進一步去除表面雜質，從中取出植物組織依次用無水乙醇、4%次氯酸鈉、硫代硫酸鈉進行表面消毒，消毒后用大量無菌水清洗以去殘留的消毒劑;取最后一步清洗液涂布LB平板檢測表面消毒是否徹底，將消毒徹底的植物組織置于超凈工作臺中吹干;然后將樣品研磨成漿液，分別取1、10、100 μL汁液涂布LB、1/10 LB固體培養基和臍橙葉汁培養基平板，每種培養基涂布5個平板，30℃培養箱中培養3～7 d，挑取單菌落至LB平板劃線，獲得純培養物。

3種培養基制備方法如下。（1）LB固體培養基：蛋白胨10 g、牛肉浸膏10 g、氯化鈉3 g、瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.5±0.5。（2）1/10LB液體培養基：用蒸餾水將LB培養基稀釋10倍后，調節pH值6.5±0.5。（3）臍橙葉汁培養基：將100 g新鮮健康臍橙葉洗凈、剪碎，加入500 mL超純水后用榨汁機榨汁，葉汁高速離心后上清經過0.22 μm過濾器進行除菌，將200 mL過濾葉汁加入等體積滅菌后的2倍水瓊脂培養基中（瓊脂 40 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.5±0.5），混合均勻后傾倒平板。

菌株的鑒定利用 CTAB 法提取菌株純培養的基因組DNA，進行16S rDNA的PCR擴增，PCR擴增引物、反應體系及擴增程序參照王芳[12]的方法。擴增產物送至湖南擎科生物測序，將測序結果在NCBI數據庫中進行 Blast 比對分析。

2 結果與分析

2.1 湘南臍橙采用不同引物進行柑橘黃龍病PCR檢測的結果

2.1.1 樣品總核酸提取質量 如圖2所示，4個樣品的總核酸提取較為成功，目的條帶亮度較高，符合后續PCR檢測要求。

2.1.2 不同引物擴增結果 如圖3所示，2號樣品和3號樣品采用P535和P400引物均擴增出柑橘黃龍病基因條帶，1號樣品只有P400引物擴增出了條帶，而16S和OI這2對引物在4個樣品中均未擴增出條帶;從擴增出的條帶亮度來看，P400引物擴增出的條帶較為清晰，且目的條帶的亮度與病害發病程度呈正相關性。因此，可以認為在柑橘黃龍病的常規PCR檢測中，湘南臍橙總核酸對P400引物的靈敏度最高，其次為P535引物，而OI和 16S這2對引物的靈敏度較低。

2.2 湘南臍橙中柑橘黃龍病株內生細菌的分離結果

試驗結果顯示，從1～3號湘南臍橙樣品中分離挑選出180株細菌，通過16S rDNA測序分析發現這些菌株分別屬于短桿菌屬（Curtobacterium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、異常球菌屬（Deinococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、甲基桿菌屬（Methylobac-terium）、微桿菌屬（Microbacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）;其中，LB，1/10LB和臍橙葉汁培養基中分別挑取60株，LB培養基中有短桿菌屬15株 、鞘氨醇單胞菌屬13株、芽孢桿菌屬13株為優勢菌屬;1/10 LB培養基中有短桿菌屬12株 、鞘氨醇單胞菌屬10株、芽孢桿菌屬8株為優勢菌屬;而在臍橙樹葉汁培養基中有短桿菌屬11株、鞘氨醇單胞菌屬8株、微桿菌屬7株為優勢菌屬;分離鑒定部分結果見表2。

3 結論與討論

柑橘黃龍病是一類專性寄生在蕓香科植物韌皮部的植物病害，研究表明，柑橘黃龍病病菌會引起篩孔堵塞，導致植物篩管運輸糖類、養分等可溶性有機物的功能喪失，最終導致植物葉片缺素、黃化、斑駁甚至枯萎死亡[13]。當前對于柑橘黃龍病既無特效治療藥物也無抗性品種，這使得該病對柑橘生產造成毀滅性打擊，號稱“柑橘癌癥”，一旦發病就無可救藥，只能做出“砍一株保一園，砍一園保一片，砍一片保一業”的下策[14-15]。而目前，湘南地區的臍橙產業發展勢頭正旺盛，特別是“宜章臍橙”因其獨特的氣候、土壤等優勢已成功申報地理證明商標。但隨著氣候變暖，柑橘木虱的北擴，使得當地許多果園出現了果樹葉片黃化，果實青化、畸形及植株枯死的現象。因此，尋求一組高特異性、高靈敏度、高穩定性的柑橘黃龍病PCR檢測引物，幫助種植戶在生產中及時、快捷地確診湘南地區臍橙的柑橘黃龍病病害顯得尤為重要，對湘南地區臍橙產業的發展也具有重要意義。此外，借助植物內生菌在植物體內普遍存在這一自然特性以及其與植物親和的天然優勢，利用內生菌來防治植物病害現已成為了一種綠色、高效的植物病害防治措施[16]。因此，研究從湘南地區幾個臍橙種植園采集柑橘黃龍病疑似病株樣品和健康植株樣品，利用柑橘黃龍病PCR檢測常用引物對樣品進行分子檢測，并從病株組織中分離內生細菌進行分析鑒定，為湘南地區臍橙的柑橘黃龍病害檢測與防控提供一定的參考。

試驗結果表明，P400引物是湘南地區臍橙中柑橘黃龍病害常規PCR檢測的最佳引物;對臍橙中柑橘黃龍病病株組織內生細菌的分離鑒定發現，柑橘中內生細菌主要歸類為7個屬，分別為短桿菌屬（Curtobacterium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、異常球菌屬（Deinococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、微桿菌屬（Microbacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）;其中，LB和1/10LB培養基中的優勢菌屬為短桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和芽孢桿菌屬;而臍橙樹葉汁培養基中的優勢菌屬為短桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和微桿菌屬。

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（責任編輯：成 平）