HPLC法同時(shí)測(cè)定赤水曬醋中9種有機(jī)酸

盧葉 張季 向麗萍 王蘭蘭 駱書娜 王奧

摘 要：本研究以赤水曬醋作為供試品，建立了一種以HPLC法檢測(cè)赤水曬醋中9種有機(jī)酸的分析方法。采用Waters XSelect HSS T3色譜柱，以20 mmol·L-1 NaH2PO4溶液為流動(dòng)相，流速0.7 mL·min-1，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，赤水曬醋樣品中9種有機(jī)酸在線性范圍內(nèi)均能達(dá)到很好的分離，相關(guān)系數(shù)≥0.999，建立的赤水曬醋有機(jī)酸的檢測(cè)方法靈敏、準(zhǔn)確，重復(fù)性好。

關(guān)鍵詞：赤水曬醋;有機(jī)酸;高效液相色譜法

Abstract：In this study， Chishui sun vinegar was used as the test sample， 9 organic acids in Chishui sun vinegar was established by HPLC. In HPLC method， organic acids was separated on a Waters XSelect HSS T3 chromatographic column with 20 mmol·L-1 NaH2PO4 solution as the mobile phase with flow rate of 0.7 mL·min-1， column temperature was maintained at 25 ℃ and the wave length was detected at 215 nm.External standard method for quantification. The results of HPLC showed that 9 organic acids displayed good linearity. The correlation coefficients （R2） of 9 organic acids were more than 0.999， the established detection method for organic acid in Chishui sun vinegar is sensitive， accurate and reproducible.

Key words：Chishui sun vinegar; Organic acids; HPLC

中圖分類號(hào)：O657.72

赤水曬醋，即在貴州赤水以傳統(tǒng)的工藝生產(chǎn)，采用固體發(fā)酵繁殖產(chǎn)生天然醋酸菌，醋坯和成品醋均經(jīng)日光曝曬，故稱“曬醋”，2015年曾獲“國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品”[1]。目前針對(duì)貴州特色食品赤水曬醋僅有關(guān)于香氣成分[2]以及菌株和微生物[3-4]的分析研究，鮮有對(duì)其中有機(jī)酸類物質(zhì)的研究報(bào)道。醋中含有豐富的有機(jī)酸，分為揮發(fā)酸和不揮發(fā)酸，其含量決定了醋滋味的柔和程度，揮發(fā)酸含量高的刺激性強(qiáng)，不揮發(fā)酸含量高的食醋刺激性小，酸味柔和[5]。有機(jī)酸類成分是赤水曬醋聞之酸香撲鼻、沁人肺腑，食之酸甜可口，濃香味美，回味綿長(zhǎng)的特別滋味的主要來(lái)源，故有必要對(duì)曬醋中有機(jī)酸類成分進(jìn)行檢測(cè)。文獻(xiàn)報(bào)道有機(jī)酸類成分的檢測(cè)多使用高效液相色譜法[6-9]、分光光度法[10]、離子色譜法[11]等。因此本研究以赤水曬醋為對(duì)象，建立并且優(yōu)化了一種HPLC對(duì)其中的有機(jī)酸類成分同時(shí)測(cè)定的方法，為赤水曬醋進(jìn)一步的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、醋酸、草酸、乳酸、焦谷氨酸，均購(gòu)自Dr Ehrenstorfer GmbH公司;檸檬酸，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldricb公司;丙酮酸，購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，純度≥98%。曬醋樣品，均為各大超市采購(gòu)，見表1;磷酸二氫鈉、磷酸，均為分析純，購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水;0.22 μm尼龍有機(jī)濾膜，購(gòu)自天津市津騰試驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）、Milli-Q Reference超純水發(fā)生器（美國(guó)Millipore公司）、AL204-IC萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量，用水溶解定容配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，其濃度分別為0.821 2 mg·mL-1（草酸）、2.006 0 mg·mL-1（酒石酸）、0.869 2 mg·mL-1（丙酮酸）、2.002 8 mg·mL-1（蘋果酸）、2.000 0 mg·mL-1（乳酸）、2.066 4 mg·mL-1（乙酸）、2.207 6 mg·mL-1（檸檬酸）、2.000 0 mg·mL-1（焦谷氨酸）、4.007 2 mg·mL-1（琥珀酸）。于4 ℃冰箱中保存，使用時(shí)根據(jù)需要用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液。

1.3.2 供試品溶液制備

移取混合均勻后的曬醋樣品5 mL于50 mL容量瓶中，用去離子水定容，充分顛倒混勻，用0.22 μm的濾膜過(guò)濾棄初濾液，取續(xù)濾液供HPLC分析用。

1.3.3 檢測(cè)條件

Agilent 1260高效液相色譜儀，流動(dòng)相：20 mmol·L-1 NaH2PO4溶液（用0.1%磷酸調(diào)pH，使pH=2.7）;流速：0.7 mL·min-1;進(jìn)樣體積：10 μL;柱溫：30℃;紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：215 nm;色譜柱：Waters XSelect HSS T3（5 μm，4.6 mm×250 mm）;等度洗脫（0～25 min）。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相pH值考察

為使有機(jī)酸盡可能以分子形式存在，一般使用酸性流動(dòng)相來(lái)抑制有機(jī)酸的解離[12]。高海燕等[13]在以磷酸氫二鉀為緩沖鹽，實(shí)現(xiàn)了11種有機(jī)酸（純草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸和琥珀酸）的良好分離，饒靜等[14]以磷酸氫二銨作為流動(dòng)相檢測(cè)蘋果醋中有機(jī)酸。本試驗(yàn)參考上述文獻(xiàn)的條件，比較了K2HPO4、（NH4）2HPO4以及NaH2PO4對(duì)有機(jī)酸分離效果的影響。首先用20 mmol·L-1的K2HPO4溶液調(diào)pH值來(lái)考察，當(dāng)pH值為2.30時(shí)，酒石酸和丙酮酸的分離度不夠理想;當(dāng)pH值為2.90時(shí)，乙酸和檸檬酸不能完全分開;當(dāng)pH值為2.70時(shí)，酒石酸、丙酮酸有了很好的分離度，乙酸與檸檬酸分離度有了一定的改善。因此選擇pH為2.70作為最適實(shí)驗(yàn)條件。鑒于乙酸與檸檬酸的分離度并未完全分離開，實(shí)際又進(jìn)一步用20 mmol·L-1的NaH2PO4溶液和20 mmol·L-1的（NH4）2HPO4溶液調(diào)pH為2.70進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用20 mmol·L-1的NaH2PO4溶液調(diào)pH時(shí)，乙酸和檸檬酸以及酒石酸、丙酮酸均能得到很好的分離。

2.1.2 樣品前處理?xiàng)l件考察

本研究考察了樣品前處理稀釋2、5、10、50倍來(lái)進(jìn)行提取，結(jié)果顯示樣品稀釋2倍和5倍時(shí)部分有機(jī)酸峰不能分開，當(dāng)樣品稀釋50倍部分峰低于檢測(cè)限，所以選擇將樣品稀釋10倍進(jìn)行處理。

2.1.3 色譜條件考察

試驗(yàn)分別將0.5、0.7、0.8、0.9 mL·min-1的測(cè)定流速進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有在0.7 mL·min-1的流速下峰型未見拖尾現(xiàn)象，并且能達(dá)到很好的分離度。

同時(shí)還對(duì)Waters XSelect HSS T3（5 μm，4.6×250 mm）色譜柱、Inertsil RODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱以及Agela Technologies Odyssil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行了摸索，發(fā)現(xiàn)Waters XSelect HSS T3（5 μm，4.6×250 mm）色譜柱對(duì)有機(jī)酸的分離有更好的效果。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

對(duì)9種有機(jī)酸在215 nm光譜下進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)品與供試品均在此波長(zhǎng)下有較強(qiáng)的吸收，標(biāo)準(zhǔn)品、樣品以及空白溶液的色譜圖見圖1所示。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 檢出限、定量限和線性方程

分別精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)溶液以表2中的線性范圍，按1.3.3色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，精密量取已知濃度的各標(biāo)準(zhǔn)溶液以表2中的線性范圍依次稀釋制成系列濃度由高到低的溶液，進(jìn)樣10 μL，測(cè)得各有機(jī)酸的檢測(cè)限（Limit of detection，LOD，S/N=3）和定量限（Limit of quantitation，LQD，S/N=10）分別以對(duì)照品的濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，得到回歸方程，9種有機(jī)酸在表2所示的線性范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999。

2.3.2 精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)

取高、中、低3種濃度的有機(jī)酸對(duì)照品溶液，在1.3.3色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄9種有機(jī)酸的色譜峰峰面積并計(jì)算峰面積的RSD<3%，表明日內(nèi)精密度良好。連續(xù)3天測(cè)試，計(jì)算峰面積的RSD<3%，表明日間精密度良好。

取同一個(gè)曬醋樣品6份，精密稱定，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，在1.3.3色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算每個(gè)有機(jī)酸色譜峰的峰面積及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD，結(jié)果如表3所示，表明方法重復(fù)性良好。

取曬醋樣品約5 mL，精密稱定，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，在1.3.3色譜條件下，分別于0、2、4、8、12、24、48 h和72 h測(cè)定，記錄9種有機(jī)酸的色譜峰的峰面積，RSD良好均符合要求，結(jié)果表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取已知含量的曬醋樣品，精密稱定，分別加入一定含量的對(duì)照品，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，在1.3.3色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算加樣回收率，平均加標(biāo)回收率如表4所示。

2.4 曬醋樣品測(cè)定

分別取市場(chǎng)收集的曬醋樣品約5 mL，精密稱定，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，制成供試品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算9種有機(jī)酸在曬醋中的含量，結(jié)果見表5。

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)供試品溶液的前處理?xiàng)l件和色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了一種能夠同時(shí)測(cè)定赤水曬醋中9種有機(jī)酸的高效液相色譜方法。結(jié)果顯示該方法有很好的線性范圍、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加標(biāo)回收率，該方法可有效去除雜質(zhì)干擾，且具有快速、便捷、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，可用于曬醋類產(chǎn)品中有機(jī)酸的準(zhǔn)確測(cè)定。

采用本文所建立的方法對(duì)赤水曬醋樣品有機(jī)酸進(jìn)行的含量分析可以看出，除了乙酸揮發(fā)酸以外，不揮發(fā)酸琥珀酸和乳酸的含量最高，其中琥珀酸為酵母菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物，具有鮮酸爽口的滋味[15]。乳酸存在能夠緩和發(fā)酵食醋中乙酸帶來(lái)的強(qiáng)烈刺激性，從而賦予食醋酸味柔和的特點(diǎn)，赤水曬醋中不揮發(fā)酸的總含量要高于揮發(fā)酸的總含量，這與其酸味柔和的滋味特點(diǎn)相符，也對(duì)赤水曬醋滋味的進(jìn)一步研究提供參考。

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4號(hào)）;貴州省科技計(jì)劃課題“貴州匯川城郊現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范園區(qū)”（編號(hào)：黔科合平臺(tái)人才[2016]5243-02號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：盧 葉（1991—），女，碩士;研究方向?yàn)槭称窓z測(cè)技術(shù)。

通信作者：王 奧（1986—），男，博士，高級(jí)工程師;研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全風(fēng)險(xiǎn)。