miR-1231通過靶向EGFR/PI3K/AKT通路抑制腦膜瘤細胞增殖研究

陳 波， 郭玉濤

(1.陜西省商洛市中心醫院神經外科， 陜西 商洛 726000 2.延安大學咸陽醫院超聲科， 陜西 咸陽 712000)

腦膜瘤是最常見的原發性顱內腫瘤，占所有原發性顱內腫瘤病例的三分之一以上，可引起顱神經麻痹、癲癇和腦干受壓，最后可能導致癱瘓、吸入性肺炎和死亡。目前腦膜瘤的治療主要以外科手術和放療為主，盡管如此，腦膜瘤復發率仍然較高[1]。miRNA是一種長度為18-25個核苷酸的小RNA，可通過與靶基因3'-UTR結合調控基因的表達。miRNA的失調與癌癥和腫瘤微環境緊密相關[2]。研究發現，miR-1231在膠質瘤中低表達，提示預后不良；細胞學實驗表明miR-1231具有抑制膠質瘤的功能[3]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)參與調控細胞增殖和動物發育，其失調與多種癌癥的惡性轉化和進展密切相關[4]。Dunn J S對腦膜瘤組織進行質譜分析發現，EGFR表達上調，且PI3K/AKT /mTOR途徑異常激活。本研究旨在探究miR-1231通過靶向EGFR/PI3K/AKT通路對腦膜瘤細胞增殖的影響，以期為腦膜瘤發病機制的闡明和開發更為有效的治療策略奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料:人腦膜瘤細胞系BEN-MEN-1購自上海拜力生物科技有限公司；原代正常人腦膜細胞和HEK-293T細胞購自中國典型培養物保藏中心；DMEM培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)、Opti-MEM購自Gibco公司；青鏈霉素混合液(100×)購自北京索萊寶科技有限公司；Lipofectamine2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自日本Takara公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京全式金公司；EGFR、p-PI3K、PI3K抗體購自英國Abcam公司；p-AKT、AKT抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗體和HRP標記二抗購自武漢三鷹；miR-1231 mimic(miR-1231)、miR-1231 mimic陰性對照(miR-NC)、miR-1231 inhibitor(anti- miR-1231)、miR-1231 inhibitor陰性對照(anti-miR-NC)、pcDNA3.1-EGFR(EGFR)和pcDNA3.1(EGFR-NC)均購自上海吉瑪制藥有限公司。

1.2方 法

1.2.1細胞培養:BEN-MEN-1細胞、原代正常人腦膜細胞和HEK-293T細胞均用DMEM培養基(含10%FBS、2mM L-谷氨酰胺、100IU/mL青霉素和100μg/ mL鏈霉素)，于37℃、5%CO2條件下培養。

1.2.2細胞轉染:BEN-MEN-1細胞或293T細胞接種于6孔板(4×105個/孔)，待細胞密度達到60～70%時進行轉染。Opti-MEM分別稀釋轉染混合物(miR-1231、miR-NC、anti-miR-1231、anti-miR-NC終濃度均為50nM，EGFR-NC和EGFR轉染量為4μg)和10μL Lipofectamine2000，總體積均為250μL，混合均勻，室溫孵育5min后，將兩者混合均勻，室溫孵育20min，隨后滴加于6孔板內，37℃，5%CO2條件下培養48h。

1.2.3熒光素酶報告基因實驗:針對EGFR 3'-UTR端序列構建野生型(WT)和突變型(MUT)報告基因質粒。參照1.2.2步驟，將EGFR-WT和EGFR-MUT分別與miR-NC、miR-1231共同轉染至HEK-293T細胞中，48h后檢測熒光素酶活性。

1.2.4RT-PCR:收集轉染后的BEN-MEN-1細胞(293T細胞)，Trizol法提取樣品中的總RNA，分光光度計測定RNA濃度，逆轉錄合成cDNA。按照SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行RT-PCR。反應條件：95℃、30s；95℃、5s，58℃、30s，40個循環；95℃、15s；58℃、30s；95℃、15s。miR-1231以U6為內參，EGFR以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-1231表達和EGFR mRNA的表達。所需引物序列見表1。

1.2.5Western blot:收集轉染后的BEN-MEN-1細胞或293T細胞，BCA法測定蛋白濃度后，取30μg蛋白進行SDS-PAGE分離蛋白，并將蛋白轉至PVDF膜上。10%脫脂奶粉室溫封閉3h，加入EGFR(1∶1500)、p-PI3K(1∶1000)、PI3K(1∶2000)、p-AKT(1∶2000)、AKT(1∶1000)和GAPDH(1∶2000)，4℃過夜孵育。HRP標記二抗(1∶2500稀釋)室溫孵育1h后，ECL發光、曝光。Image J分析條帶灰度值，以目的條帶與GAPDH比值表示目的蛋白相對表達量。

表1 RT-PCR所需引物

1.2.6CCK-8:BEN-MEN-1細胞經0.25%胰酶消化后，用DMEM培養基重懸細胞，向96孔板中每孔加入100μL細胞懸液(5×104個/mL)。37℃、5%CO2條件下繼續培養。在細胞培養12h、24h、48h、72h后，向每孔內加入10μL CCK-8溶液，37℃、5%CO2條件下孵育3h。酶標儀測定各孔在450nm處的光密度(OD)值。

1.2.7集落形成實驗:BEN-MEN-1細胞經0.25%胰酶消化后，用DMEM培養基重懸細胞，以1×103個/孔密度接種于6孔板，37℃、5%CO2條件下連續培養2周。PBS清洗細胞，4%多聚甲醇固定30min，1%結晶紫染色10min。PBS洗滌細胞，晾干，拍照并計數。

1.2.8EdU實驗:BEN-MEN-1細胞以每孔5×103個細胞量接種于96孔板，37℃、5%CO2條件下培養24h。DMEM培養基以1000∶1比例稀釋EdU溶液，終濃度為50μm。每孔加入100μL EdU培養基37℃孵育2h后，移除培養基。PBS清洗細胞后，4%多聚甲醛固定細胞，0.5%Triton X-100通透，隨后EdU Alexa-Fluor 594進行熒光標記，Hoechst 33342染核。PBS清洗細胞后，置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結 果

2.1BEN-MEN-1細胞中miR-1231表達下調，EGFR表達上調:RT-PCR和Western blot實驗結果顯示，與正常人腦膜細胞相比，BEN-MEN-1細胞中miR-1231表達顯著下調(圖1A，P<0.05)，EGFR mRNA和蛋白表達均顯著上調(圖1A、B，P<0.05)。

圖1 BEN-MEN-1細胞中miR-1231和EGFR的表達

2.2miR-1231抑制BEN-MEN-1細胞增殖:由CCK-8、集落形成實驗和EdU實驗結果可知，與miR-NC組相比，miR-1231組細胞活力顯著下調(圖2A，P<0.05)，細胞克隆數和EdU陽性細胞數顯著下調(圖2B、C，P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-1231組細胞活力顯著上調(圖2A，P<0.05)，細胞克隆數和EdU陽性細胞數顯著上調(圖2B、C，P<0.05)。

2.3miR-1231靶向抑制EGFR/PI3K/AKT通路:miR-1231與EGFR 3'-UTR結合位點見圖3A。熒光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-1231可顯著降低野生型EGFR 3'-UTR報告基因的相對熒光素酶活性(圖3B，P<0.05)，而對突變型EGFR 3'-UTR報告基因的相對熒光素酶活性無顯著影響(圖3B，P>0.05)。miR-1231顯著下調BEN-MEN-1細胞中EGFR、p-PI3K和p-AKT表達(圖3C，P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-1231顯著上調BEN-MEN-1細胞中EGFR蛋白表達、PI3K和AKT磷酸化水平(圖3C，P<0.05)。

圖3 miR-1231靶向抑制EGFR / PI3K / AKT通路

2.4miR-1231通過抑制EGFR/PI3K/AKT通路抑制BEN-MEN-1細胞增殖:由Western blot、CCK-8、集落形成實驗和EdU實驗結果可知，與miR-NC+EGFR-NC組相比，miR-1231+EGFR-NC組細胞EGFR蛋白表達、PI3K和AKT磷酸化水平均顯著下調(圖4A，P<0.05)，細胞活力和增殖能力均顯著下調(圖4B、C、D，P<0.05)；與miR-NC+EGFR-NC組相比，miR-NC+EGFR組細胞EGFR蛋白表達、PI3K和AKT磷酸化水平均顯著上調(圖4A，P<0.05)，細胞活力和增殖能力均顯著上調(圖4B、C、D，P<0.05)；與miR-1231+EGFR-NC組相比，miR-1231+EGFR組細胞EGFR蛋白表達、PI3K 和AKT磷酸化水平均顯著上調(圖4A，P<0.05)，細胞活力和增殖能力均顯著上調(圖4B、C、D，P<0.05)。

圖4 miR-1231通過抑制EGFR/PI3K/AKT通路抑制BEN-MEN-1細胞增殖

3 討 論

腦膜瘤是最常見的中樞神經系統腫瘤之一，也是迄今為止最常見的軸外腫瘤[5]。手術切除是治療腦膜瘤的主要方式之一。然而，由于解剖學上的復雜性和與附近關鍵結構的接近性，僅有約50%的病例實現了腫瘤的完全切除[6]。已有研究證明多種miRNA與腦膜瘤的發展密切相關[7]。miR-1231在神經膠質瘤和前列腺癌中低表達且與其預后相關[3]。然而，miR-1231在腦膜瘤中的作用還尚未可知。

miR-1231是miRNA家族成員之一，miR-1231在胰腺癌患者血漿和胰腺癌細胞中表達下調[8]。已有研究證明，過表達miR-1231抑制胰腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲和BALB/C裸鼠體內腫瘤的生長[9]。本研究結果顯示，腦膜瘤細胞中miR-1231表達下調，過表達miR-1231抑制腦膜瘤細胞增殖，干擾miR-1231后則促進腦膜瘤細胞增殖。這些結果提示，miR-1231具有腫瘤抑制因子的作用。

EGFR在腫瘤細胞增殖、分化和抗凋亡中起調節作用，它的異常表達可以促進腫瘤細胞的增殖、粘附、轉移和侵襲。由本研究結果可知，腦膜瘤細胞中EGFR表達上調，提示EGFR可能在腦膜瘤中發揮促腫瘤作用。研究表明，過表達miR-1231通過靶向EGFR抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[8]。本研究結果顯示，miR-1231靶向調控EGFR抑制腦膜瘤細胞的增殖。

EGFR與相關配體的結合可以激活PI3K/AKT信號通路[10]。本研究結果顯示，在腦膜瘤細胞中，過表達EGFR可活化PI3K/AKT信號通路。研究證明，PI3K/AKT信號通路的異常與腫瘤的生長、維持和化學抗性有關[11]。激活EGFR/PI3K/Akt/mTOR通路可促進神經膠質瘤的惡性特征[12]。由本研究結果可知，miR-1231通過靶向EGFR抑制PI3K/AKT通路活化，從而抑制腦膜瘤細胞增殖，過表達EGFR則可逆轉miR-1231對PI3K/AKT通路及腦膜瘤細胞增殖的抑制作用。

綜上所述，miR-1231通過靶向EGFR抑制PI3K/AKT通路活化，從而抑制腦膜瘤細胞增殖。該研究有利于進一步揭示腦膜瘤的致病機制，為腦膜瘤的治療提供了新的靶點。miR-1231通過靶向EGFR調節PI3K/AKT通路對腦膜瘤凋亡、自噬等其他生物學進程的影響還需進一步實驗研究。