基質金屬蛋白酶-2、9基因多態性與子宮內膜息肉發病風險的研究

唐世倩，李晟輝，褚春芳，劉菊紅，李珊珊，趙 虹

（首都醫科大學附屬北京婦產醫院 婦科，北京 100026）

子宮內膜息肉（endometrial polyps，EP）是子宮內膜的良性病變，也是婦科常見疾病，可發生于青春期后的任何年齡，隨著年齡增加發病率呈現上升趨勢[1～3]。EP 可以引起異常子宮出血、不孕等多種問題，因此越來越受到人們的關注。

研究發現，參與機體炎癥表達的基質金屬蛋白酶-2 （MMP-2）、MMP-9 在EP 組織中表達升高，推測其可能參與了EP 的發生發展，但其作用機理并不清楚。眾多研究表明多種疾病中MMP-2及MMP-9 的改變均與其基因啟動子區域位點的多態性相關，而在EP 組織中是否也存在MMP-2及MMP-9 基因多態性的改變，尚未見報道。因此，本研究將探討MMP-2 基因啟動子區-735C/T位點及MMP-9 基因啟動子區-1562C/T 位點多態性與EP 的相關性，以期深入了解EP 發生機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2017年4月～2019年8月在首都醫科大學附屬北京婦產醫院就診，行手術治療，經病理證實為子宮內膜息肉組織標本82 例，作為實驗組。以年齡為匹配條件的同期于首都醫科大學附屬北京婦產醫院行子宮內膜活檢及正常絕經后婦女因子宮脫垂行子宮切除術的標本51 例，經病理證實為正常子宮內膜組織，作為對照組。所有研究對象既往均未使用激素藥物治療，且無甲狀腺、子宮肌瘤、惡性腫瘤、糖尿病、多囊卵巢綜合征等病史。本研究經倫理委員會批準，所有研究對象在納入試驗前均被詳細告知本研究的目的和研究方法，并簽署了知情同意書。

1.2 標本采集及DNA 提取

組織標本均采用傳統的酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，經紫外分光光度計測DNA 濃度及純度。

1.3 MMP-2 基因分型

采用聚合酶鏈反應限制性片段長度多態性技術（PCR-RFLP）法對MMP-2 啟動子-735C/T 位點單核苷酸多態性進行基因分型。擴增MMP-2啟動子-735C/T 位點的上游引物為 5' -ATAGGGTAAACCTCCCCACATT- 3'；下游引物為5'-GGTAAAATGAGGCTGAGACCTG-3'。PCR 反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性45s，65.5℃退火45s，72℃延伸45s，經35 個循環，72℃總延伸7min。PCR 產物經限制性內切酶Hinf I（TakaRa生物工程（大連）有限公司合成），于37℃16h 酶切后，于3.0%的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓85V，30min。電泳后，紫外燈下觀察結果，記錄并繪制電泳圖譜。PCR 產物 為300bp，T/T 基因型因 存在Hinf I 的識別位點，產生254bp 和46bp 2 條DNA片段，C/C 基因型因缺乏Hinf I 的識別位點保持原有PCR 產物300bp 片段，C/T 基因型則顯示為300bp、254bp 和46bp 三條片段（圖1）。

1.4 MMP-9 基因分型

采用PCR-RFLP 法對MMP-9 啟動子-1562C/T 位點進行單核苷酸多態性基因分型。擴增MMP-9 啟動子-1562C/T 位點上游引物為5'-GCCTGG CAC ATA GTA GGC CC-3'，下游引物為5'-CTT CCT AGC CAG CCG GCA TC-3'。PCR反 應條 件為：94℃預變 性5min，94℃變 性35s、63.5℃退火40s，70℃延伸50s，經40 個循環，72℃總延伸5min。PCR 產物經限制性內切酶SphI（TakaRa 生物工程大連有限公司合成） 于37℃恒溫水浴過夜約16h 酶切后，進行3.0%瓊脂糖凝膠電泳，電壓85V，30min。電泳后，紫外燈下觀察結果，記錄并繪制電泳圖譜。PCR 產物為435bp，T/T基因型產生188bp 和247bp 兩條DNA 片段，C/C基因型因缺乏識別位點保持原有PCR 產物435bp 片段，C/T 基因型有435、247、188bp 3 個片段（圖1）。

圖1 MMP-2、MMP-9 酶切后PCR 擴增產物

1.5 統計學方法

應用SPSS17.0 統計軟件，所測基因型和等位基因頻率均采用基因直接計數法計算，Hardy-Weinberg平衡檢驗檢測對照組和病例組中各基因型頻率，確定選擇對象的隨機性。檢驗比較正常對照組與病例組間基因型和等位基因分布頻率的差異。經年齡矯正，以非條件Logistic 回歸法計算優勢比（OR）及其95%可信區間（CI）表示相對風險度。

2 結果

2.1 研究對象的一般特征

病例組平均年齡為49.37±1.32 歲，對照組平均年齡44.17±1.69 歲，2 組相比較差異無統計學意義 （P＞0.05），具有可比性。病例組及對照組MMP-2 啟動子-735C/T 位點基因型分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（均P＞0.05），病例組及對照組MMP-9 啟動子-1562C/T 位點基因型分布也符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律 （均P＞0.05）。

2.2 MMP-2 啟動子-735C/T 位點基因型及等位基因頻率分布比較

在子宮內膜息肉組織中，MMP-2 啟動子-735C/T 位 點T/T、C/T、C/C基因型頻率分別為42.68%、51.22%、6.10%，與對照組比較差異有顯著性（P＜0.05）。與C/T、C/C 基因型相比，T/T 基因型使子宮內膜息肉的發病風險增加約2.7 倍（OR=2.708；95%CI 1.219～6.014）。并且T、C 等位基因頻率分布差異有顯著性 （P＜0.05）（表1）。-735C/T 位點T 等位基因使子宮內膜息肉的發病風險增加約2.8 倍 （OR=2.839；95%CI 1.377 ～5.853）。

表1 2 組研究對象MMP-2、MMP-9基因型及等位基因的分布

2.3 病例組及對照組MMP-9 啟動子-1562C/T位點基因型及等位基因頻率分布比較

在子宮內膜息肉組織中，MMP-9 啟動子-1562C/T 位 點T/T、C/T、C/C 基因型頻率分別為40.24%、39.02%、20.73%，與對照組比較差異有顯著性（P＜0.05）。與C/C 基因型相比，C/T、T/T 基因型使子宮內膜息肉的發病風險增加約2.3 倍（OR=2.270；95%CI 1.041～4.949）。但T、C 等位基因頻率分布差異無統計學意義（P＜0.05）（表1）。

3 討論

子宮內膜息肉由子宮內膜腺體，間質和血管組成，是子宮局部內膜過度增殖引起的內膜病變，發病率約1%～8%[4]，較小的息肉可無臨床癥狀，僅在行超聲檢查時發現，但體積較大的息肉可引起不規則陰道出血、不孕等多種臨床癥狀，部分患者子宮內膜息肉反復發生，甚至會發生惡變[5，6]，嚴重影響人們健康。

迄今為止，子宮內膜息肉的發生機制并不完全明確，目前普遍認為其發生原因與子宮內膜的炎癥、體內激素環境紊亂、細胞因子及受體失調，細胞增殖凋亡失衡相關，其中炎癥因素受到人們的廣泛關注，當子宮內膜出現炎癥時，內膜腺上皮和間質細胞致炎因子、血管形成因子的表達上調，從而引起內膜增生，息肉形成。

基質金屬蛋白酶（MMPs）是目前研究較多的與機體炎癥改變相關的酶類，它是一類依賴于鋅、鈣的內源性蛋白水解酶，主要由內皮細胞、血管平滑肌、巨噬細胞等產生[7]，目前已經發現的MMPs有26 種，其主要生理功能是降解細胞外基質成分，維持細胞外基質的動態平衡，參與人體的生理及病理過程[8，9]。正常生理情況下，MMPs 在機體內表達量極低，而在胚胎形成、炎癥、新生血管生成、腫瘤細胞的生長和轉移等條件下表達水平顯著升高[10]。

MMP-2、MMP-9 均為基質金屬蛋白酶家族的重要成員，他們由肝細胞分泌，屬于明膠酶，主要作用為降解基膜的IV 型膠原，參與炎癥的發生及擴散，血管的形成等病理變化[11，12]。為了明確MMP-2、MMP-9 是否與子宮內膜息肉這一疾病發病相關，2014年張希奇等人研究發現與正常子宮內膜組織相比，在子宮內膜息肉組織中，MMP-2、MMP-9 均呈現出高表達[13]，2016年，張勤等人再次驗證了這一結果[14]，這些研究表明MMP-2、MMP-9 在子宮內膜息肉組織中表達升高，但引起其升高的原因尚不清楚。

作為酶類，MMPs 的活性可受多個位點調節，研究證實MMPs 啟動子區多態性位點在人群中的分布可能會導致MMP 表達水平的差異，導致某些疾病在人群中的易感性不同[15]。MMP-2 基因啟動子區域-735C/T 位點單核苷酸多態可導致內轉錄因子SP1 結合區的序列發生改變，阻礙了啟動子SP1 結合區結合特異的核內蛋白，從而改變基因轉錄的活性及水平[16]，研究發現MMP2 啟動子區-735 C/T的C/C 基因型與食管癌風險和轉移風險增加相關[17]，C 等位基因與乳腺癌風險增加有關[18]，當T/T 基因型與C/T 基因型存在時，膀胱癌風險增加[19]。此外，研究還發現MMP-2 啟動子-735C/T 位點單核苷酸多態性與骨髓增生疾病[20]、卵巢癌[21]等疾病具有相關性。本實驗中通過對實驗組和對照組組織的MMP-2 啟動子區-735C/T位點進行基因多態性檢測，結果發現兩組間等位基因頻率具有顯著差異性（P<0.01），其中T/T 基因型、T 等位基因均明顯增加子宮內膜息肉的發病風險，OR 值分別為2.708、2.839，這表明MMP-2 啟動子-735C/T 位點多態性的改變可以影響子宮內膜息肉的患病風險。

同樣，1999年Zhang 等人[22]發現MMP-9 基因啟動子區域存在-1562C/T 多態性，其位點位于MMP-9 基因啟動子的轉錄起始位點，同時是轉錄抑制因子所識別的位點。C/T 的改變可破壞轉錄抑制因子的識別以及結合的序列位點，因此，具有顯著增強啟動子活性的作用[23]。但目前發現，MMP-9 基因啟動子區域-1562C/T 位點上兩個等位基因在不同疾病中的作用不同。2007年Sfar 等人發現C 等位基因可降低前列腺癌的發病風險，而T 等位基因則會將前列腺癌發病風險提升3倍[24]，同年Rollin 等人發現，C 等位基因與肺鱗狀細胞癌的風險增加有關[25]。在本研究中，子宮內膜息肉組織標本與正常子宮內膜組織標本相比較，MMP-9 啟動子-1562C/T 位點等位基因的頻率具有顯著性（P<0.05），與C/C 基因型相比，C/T、T/T基因型可使子宮內膜息肉的發病風險增加2.270倍，由此推斷C/T、T/T 基因型與子宮內膜息肉的易感性正相關。

本實驗通過聚合酶鏈反應限制性片段長度多態性技術檢測方法，首次探討了MMP-2 基因啟動子區域-735C/T 及MMP-9 啟動子-1562C/T 基因多態性與子宮內膜息肉之間發病關系，結果發現不同的基因型及等位基因會影響子宮內膜息肉易感性，這一結果將為進一步探討子宮內膜息肉的發病機制提供理論依據。