金訶含片促進巨噬細胞吞噬功能作用研究

張義智，邵成雷，單玉剛，王海蘋，侯曉群通訊作者）

（1.金訶藏藥（山東）健康產業有限公司，山東 濟南 250101；2.青島市市立醫院，山東 青島 266011）

1 實驗目的

觀察評價金訶含片對活性炭處理的斑馬魚模型巨噬細胞免疫功能的促進作用，為金訶含片在抗PM2.5領域開發提供參考。

2 實驗動物

黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚240尾，自然成對交配繁殖方式進行，受精后2天，用于金訶含片對巨噬細胞吞噬功能的促進作用實驗。

上述Albino品系斑馬魚均飼養于28℃的斑馬魚專用養殖水中（pH為6.9-7.2；速溶海鹽含量200 mg/L；電導率為485-505μS/cm的反滲透水；硬度為53.5-71.5 mg/LCaCO3），實驗動物試驗使用許可證號為：SYXK（浙）2012-0171。斑馬魚飼養管理完全符合國際AAALAC認證相關要求[1-5]。

3 實驗藥物

金訶含片，棕色粉末，于2017年09月11日收樣，由金訶藏藥（山東）健康產業有限公司提供，常溫陰涼避光保存。使用前用超純水配制成濃度為50mg/ mL的溶液，-20℃保存。臨用時用養魚水按需稀釋。

金嗓子喉片，市售成品，棕褐色片劑，批號17031301，于2017年09月11日收樣，由金訶藏藥（山東）健康產業有限公司提供，常溫陰涼避光保存。臨用前用超純水配制成濃度為200 mg/ mL的母液，-20℃保存。臨用時用養魚水按需稀釋。

4 儀器與試劑

解剖顯微鏡（SZX7，OLYMPUS，Japan）；6孔板（Fisher Scientific，China）；精密電子天平（CP214，奧豪斯）；顯微注射儀（IM-300，Narishige）；拉針儀（PC-10，Narishige，Japan）；中性紅（Sigma，China）；甲基纖維素（Sigma，China）。

5 濃度組別

實驗1組 正常對照組；實驗2組 模型對照組；實驗3組 金訶含片56 μg/ mL；實驗4組 金訶含片167 μg/mL；實驗5組 金訶含片500 μg/ mL；實驗6組 金嗓子喉片 222 μg/ mL；實驗7組 金嗓子喉片 667 μg/ mL；實驗8組 金嗓子喉片 2000 μg/ mL。

6 濃度確定依據

根據金訶含片（對斑馬魚的最大耐受濃度（MTC）為500 μg/ mL）和金嗓子喉片（對斑馬魚的最大耐受濃度（MTC）大于2000 μg/ mL）對斑馬魚的最大耐受濃度（MTC），確定對巨噬細胞吞噬功能的促進作用評價濃度為：金訶含片分別為56 μg/ mL（1/9 MTC）、167μg/ mL（1/3 MTC）和500 μg/ mL（MTC）濃度；金嗓子喉片分別為222 μg/ mL（1/9 MTC）、667 μg/ mL（1/3 MTC）和2000 μg/ mL（MTC）濃度。

7 模型制作

將2.3 mg/ mL納米活性炭作為PM2.5納米顆粒，注射到2 dpf斑馬魚的靜脈中（相當于人靜脈注射），每尾斑馬魚注射10 nL，即以23 ng/尾的劑量建立斑馬魚PM2.5吞噬模型。

8 實驗方法

隨機選取240尾受精后2天（2 dpf）黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚，靜脈注射給予納米活性炭（PM2.5）建立斑馬魚巨噬細胞吞噬功能評價模型。模型斑馬魚分別水溶給予金訶含片56、167、500 μg/ mL濃度和金嗓子喉片222、667、2000 μg/ mL濃度，同時設置正常對照組和模型對照組，每孔（實驗組）均處理30尾斑馬魚，每孔容量為3 mL，并且每天更換藥液。金訶含片和金嗓子喉片處理2天后，加入中性紅溶液對斑馬魚進行活體染色，染色結束后統計吞噬了納米活性炭的巨噬細胞數量（N），以巨噬細胞吞噬促進率評價金訶含片對斑馬魚體內巨噬細胞吞噬功能的影響。金訶含片對斑馬魚巨噬細胞吞噬功能的促進作用計算公式如下：

用方差分析和Dunnett’s T-檢驗進行統計學分析，P＜0.05表明具有顯著性差異，提供具有代表性的實驗圖譜。

9 實驗結果

金訶含片濃度為56和167 μg/ mL時，斑馬魚吞噬的納米活性炭的巨噬細胞數量分別為44和38個，與模型對照組（28個）比較P＜0.001，其對斑馬魚巨噬細胞吞噬促進率分別為53.5%和32.7%；在500 μg/mL濃度時，斑馬魚吞噬的納米活性炭的巨噬細胞數量為34個，與模型對照組比較P＜0.01，其對斑馬魚巨噬細胞吞噬促進率為19.0%。提示金訶含片在56、167和500 μg/mL濃度時對斑馬魚巨噬細胞吞噬功能都有明顯的促進作用[6-9]。金嗓子喉片濃度為222、667和2000 μg/ mL時，斑馬魚吞噬的納米活性炭的巨噬細胞數量分別為41、45和40個，與模型對照組（28個）比較P＜0.001，其對斑馬魚巨噬細胞吞噬促進率為44.7%、56.7%和41.9%，提示金嗓子喉片在222、667和2000 μg/mL濃度時對斑馬魚巨噬細胞吞噬功能有明顯的促進作用，見表1-2。

表1 金訶含片對斑馬魚巨噬細胞吞噬功能促進作用實驗結果

10 實驗結論

本實驗結果表明，金訶含片對斑馬魚巨噬細胞吞噬功能有明顯的促進作用。國內外文獻報道，斑馬魚模型在現代藥學研究中關于疾病動物模型、藥物活性篩選及代謝研究方向的研究取得了很大進展[10-11]。本實驗首次將斑馬魚模型用于評價抗霧霾作用，為其拓展應用提供了參考。