花椰菜苗期黑腐病抗、感品種轉錄組差異表達分析

姚玉榮，霍建飛，郝永娟，賁海燕，王萬立

（1.天津科潤農業科技股份有限公司／蔬菜種質創新國家重點實驗室，天津 300384；2.天津市植物保護研究所，天津 300384）

花椰菜（Brassica oleraceaL.var.botrytis）是十字花科蕓薹屬甘藍的變種，以花球為食用器官的蔬菜。花椰菜除含有多種營養物質外，還含有類黃酮、硫代葡萄糖苷、黑子芥酶等生物活性成分［1］，深受廣大消費者喜愛。據2018年FAO（聯合國糧食及農業組織）報告顯示，全世界花椰菜的栽培面積約141.78萬公頃，中國為54.79萬公頃，占世界總栽培面積的38.64%［2］，現已成為世界上花椰菜種植面積最大的國家。

黑腐病是由野油菜黃單胞菌野油菜致病變種Xanthomonas campestrispv.campestiss引起的細菌性病害［3］，也是制約花椰菜生產的主要病害之一，發病率為20% ～30%，嚴重時可達50% ～60%［4］。目前，黑腐病防治方法主要有農事操作如輪作、化學防治和選育抗性品種等。其中，最經濟有效的措施為培育和利用抗病品種。由于尚未找到有效抗原，前期研究對黑腐病抗病基因的挖掘和鑒定進展緩慢。隨著分子生物學技術的發展和應用，RNA-Seq技術現已廣泛應用于基因差異表達研究［5-7］。Chu等［8］利用RNA-Seq技術從抗、感白菜植株中鑒定出2 000多個呈現差異表達的基因，它們主要在茉莉酸和乙烯信號通路、胼胝質沉淀及吲哚類物質合成等過程中發揮作用，且均在抗病植株中表達水平顯著上調。Chen等［9］通過對大白菜根腫病抗病和感病品種轉錄組進行測序和分析發現，抗、感品種間存在151個抗病相關差異基因，主要參與PAMPs、效應子識別、激素信號轉導和細胞壁修飾等過程。Zhang等［10］對不同根腫菌侵染時期的青花菜轉錄組進行比較分析發現，抗、感品種間在NBS-LRR基因、SA代謝相關基因、JA代謝相關基因、細胞壁重塑基因、幾丁質酶基因等存在表達差異，這些基因參與寄主對病原菌抗病響應途徑，從而使抗、感品種呈現不同抗病性。郭珍等［11］對接菌后油菜根腫病抗、感品種基因進行差異表達分析發現，它們分別存在6 607個和2 499個差異表達基因。雷陽等［12］對114份辣椒群體進行抗疫病鑒定，并對篩選得到的1份抗病材料和3份感病材料進行RNA-Seq測序分析，發現三組材料中有331個差異表達基因，包括68個上調基因和263個下調基因。

目前，多基因控制的抗性機制的研究在擬南芥中較為成熟［13］，且相關研究發現，十字花科黑腐病抗性是多基因控制的數量性狀［14］。因此，利用轉錄組分析來研究十字花科黑腐病抗性機制具有可行性。基于此，本研究利用RNA-Seq技術測定并分析花椰菜黑腐病抗、感品種間抗病相關基因的差異表達，以期為后續抗病基因的挖掘及花椰菜抗病育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種：花椰菜黑腐病感病品種Y1-2和抗病品種EC-247，均由天津科潤農業科技股份有限公司蔬菜研究所提供。

供試菌株：黑腐病菌為野油菜黃單胞菌野油菜致病變種Xanthomonas campestrispv.campestiss，由天津市植物保護研究所蔬菜病害實驗室分離保存。

1.2 樣品制備

試驗于2019年4月在天津市植物保護研究所實驗室進行。育苗基質為蛭石∶草炭∶土壤＝1∶1∶2（體積比），滅菌后備用。將花椰菜黑腐病抗、感品種的種子分別用50℃熱水處理10 min后播于育苗穴盤內，置于防蟲網室培養。加強栽培管理，使幼苗生長健壯、整齊一致。

接種菌液的準備：將黑腐病菌菌株轉接于LB液體培養基上，置于28℃搖床恒溫培養24 h，加適量無菌水稀釋，并用細菌濁度儀調整菌液濃度至每毫升1×108個菌體，備用。

于各幼苗長至4～5片真葉時移到人工氣候室內保濕24 h，使其葉緣出現露珠。參照姚星偉等［15］的方法進行接種：將制備接種菌液用小型噴霧器進行噴霧接種，均勻噴至幼苗葉片。幼苗接種后培養條件為28℃、相對濕度80%，每天光照14 h。

接種5 d后觀察發病情況，同時用無菌剪刀剪下葉片并迅速置于液氮中，再將其移至-80℃保存備用。每品種設置3次重復，每重復15株幼苗。

1.3 RNA提取、測序及組裝

將抗、感品種的每個重復混合磨樣，用Trizol試劑提取總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性和純度，NanoDrop 2000檢測RNA濃度，合格后送至上海美吉生物科技有限公司進行Illunmina測序。

利用Trinity軟件對6個樣本的clean reads從頭組裝，用于后續分析。

1.4 差異表達基因分析及注釋

利用RSEM 軟件將每個花椰菜樣本clean reads比對到參考序列，每個基因表達水平用FPKM值計算，有多個轉錄本的基因，選擇最長轉錄本計算FPKM值。使用DESeq2軟件篩選2個樣本間的差異表達基因（differential expressed genes，DEGs）。為減少假陽性，對P-value值進行矯正，矯正后P-value＜0.05，｜log2FC｜＞1設為基因差異顯著表達閾值。

所有表達基因基于6個數據庫進行注釋，包括：NR（non-redundant protein sequence database）、Swiss-Prot、Pfam、COG（clusters of orthologous groups）、GO（gene ontology）、KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）。對于具有多個匹配蛋白序列的基因，選取相似性最高的蛋白質作為最優注釋。

1.5 數據分析

利用RSEM軟件計算抗、感品種生物學重復之間的Pearson相關系數，并繪制基因表達矩陣圖對樣本間基因表達相關性進行分析。利用DESeq2軟件繪制差異表達基因火山圖。

2 結果與分析

2.1 接種黑腐病病菌后葉片發病情況

由圖1可以看出，黑腐病病原菌懸浮液接種5 d后，感病品種Y1-2葉片表現出黑腐病典型的“V”形黃褐色病斑，而抗病品種EC-247葉片未呈現該典型病斑。

2.2 轉錄組質量分析

對花椰菜感病品種Y1-2及抗病品種EC-247接種5 d后的樣本進行測序后，本研究構建了6個cDNA文庫。過濾后獲得49.01×106～55.39×106個平均片段為150 bp的clean reads，GC含量為47.15%～47.80%，Q≥30占比為93.63%～95.16%（表1），表明測序數據質量較好，可以用于后續分析。

2.3 樣本間基因表達量分析

花椰菜抗、感品種間基因表達量相關性的聚類分析結果（圖2A）顯示，抗病品種EC-247和感病品種Y1-2樣本各自聚在一起，且表達差異明顯。試驗中EC-247 5DAI_1～3（E_5DAI）和Y1-2 5DAI_1～3（Y_5DAI）的unigenge數量分別為24 227、25 436個，6個樣本共表達的unigene數量為22 570個（圖2B）。

2.4 基因表達差異分析

由圖3可以看出，花椰菜黑腐病抗、感品種差異表達基因共3 195個，其中上調表達基因1 424個，占差異表達基因的44.57%；下調表達基因1 771個，占差異表達基因的55.43%。因此，抗、感品種差異顯著性強的基因可能與花椰菜黑腐病抗病性相關。

圖2 抗、感病花椰菜品種間基因表達量相關性分析（A）和基因表達韋恩圖（B）

圖3 花椰菜黑腐病抗、感品種轉錄組表達量差異統計（A）和差異表達基因火山圖（B）

2.5 差異表達基因的功能注釋與富集分析

由圖4可以看出，GO數據庫中，抗、感品種在接種黑腐病菌5 d時，差異表達基因被富集到3個GO分類，分別是細胞組成、分子功能和生物代謝。差異表達基因富集數目最多的功能是細胞組成，其中以細胞膜（membrane）、細胞（cell）和細胞膜部分（membrane part）數量最多，占比為55.92%；生物代謝分類中基因富集數目最多的功能是細胞過程、代謝過程以及單有機體過程；分子功能注釋基因主要包括結合（binding）749個基因，占比46.55%、催化活性（catalytic activity）606個基因，占比37.66%。

圖4 花椰菜黑腐病抗、感品種差異表達基因GO功能注釋

將花椰菜黑腐病抗、感品種差異表達基因與KEGG數據庫進行比對，挖掘抗病和感病品種中差異基因顯著富集的KEGG通路（圖5）。其中上調表達基因富集到94條通路，顯著富集的主要包括苯丙素生物合成（phenylpropanoid biosynthesis），N-聚糖生物合成（N-glycan biosynthesis），亞油酸代謝（linoleic acid metabolism），二苯乙烯、二芳庚烯和姜辣素的生物合成（stilbenoid，diarylheptanoid and gingerol biosynthesis），苯丙氨酸代謝（phenylalanine metabolism），角質、軟木脂和蠟質生物合成（cutin，suberine and wax biosynthesis），氨基糖和核苷酸糖代謝（amino sugar and nucleotide sugar metabolism），類固醇生物合成（steroid biosynthesis）和光合作用（photosynthesis）共9條通路（圖5A）。下調基因富集到87條通路，顯著富集的有錯配修復（mismatch repair）、DNA復制（DNA replicatioin）、核苷酸切除修復（nucleotide excision repair）、同源重組（homologous recombination）、醚脂類代謝（ether lipid metabolism）、苯丙素生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、植物晝夜節律（circadian rhythm plant）、類黃酮生物合成（flavonoid biosynthesis）、植物-病原互作（plant-pathogen interaction）、植物MAPK信號通路（MAPK signaling pathway-plant）、核黃素代謝（riboflavin metabolism）11條代謝通路（圖5B）。

圖5 花椰菜黑腐病抗、感品種差異表達基因KEGG通路

3 討論與結論

本研究利用RNA-Seq技術分析了黑腐病菌野油菜黃單胞菌野油菜致病變種接種5 d后的花椰菜抗、感病品種間基因轉錄差異，得出抗病品種E_5DAI和感病品種Y_5DAI的unigenge數量分別為24 227、25 436個，6個樣本共表達的unigene數量為22 570個；花椰菜抗、感病品種間共有差異表達基因3 195個，其中上調表達基因1 424個，下調表達基因1 771個。通過GO和KEGG進行基因功能注釋和顯著性富集分析發現，上調表達的基因主要富集在苯丙素生物合成，N-聚糖生物合成，亞油酸代謝，二苯乙烯、二芳庚烯和姜辣素的生物合成，苯丙氨酸代謝，角質、軟木脂和蠟質生物合成，氨基糖和核苷酸糖代謝，以及類固醇生物合成和光合作用等途徑；下調表達基因主要富集在錯配修復、DNA復制、核苷酸切除修復、同源重組、醚脂類代謝、苯丙素生物合成、植物晝夜節律、類黃酮生物合成、植物-病原互作、植物MAPK信號通路和核黃素代謝等代謝通路。該類差異基因主要集中于苯丙烷類代謝、次級代謝產物合成、逆境響應、MAPK信號通路等途徑。

苯丙烷類代謝是植物防御反應的主要次級代謝路徑之一，參與植保素、木質素、類黃酮、生物堿等與植物防御反應相關物質的合成［16，17］，這些物質對真菌、細菌有抑制活性［18-21］。本研究中花椰菜黑腐病抗、感品種差異表達基因在類黃酮生物合成通路顯著富集。因此，推測類黃酮途徑與花椰菜黑腐病抗病性相關。核黃素能夠提高植物抗病性，彭建令［22］發現核黃素能夠啟動番茄Pto介導的Ptis級聯反應，提高對細菌的抗性。此外，蛋白酶類可通過磷酸化和去磷酸化參與調節各種細胞反應，應答環境脅迫［23，24］。

本研究通過高通量測序對花椰菜抗病和感病品種接種黑腐病后基因轉錄本差異進行了分析，可為在轉錄水平上全面了解花椰菜抗黑腐病的分子基礎提供參考。