山東省小麥白粉病菌群體毒性鑒定和分析

張眉，郭霞，辛志梅，王升吉，辛相啟，姜珊珊，吳斌

（山東省農業科學院植物保護研究所／山東省植物病毒學重點實驗室，山東 濟南 250100）

小麥是山東省主要糧食作物，其產量和品質極大關系著糧食安全［1］。小麥白粉病是小麥的主要病害之一，多以病菌孢子隨氣流傳播，具有流行速度快、危害范圍廣、控制難度大等特點。近年來發生頻繁，危害損失嚴重，已逐漸成為限制小麥穩產、高產的主要因素之一，嚴重威脅著小麥的安全生產［2，3］。在眾多防治措施中，選育和應用優質、抗病品種是防治小麥白粉病最經濟有效的措施。由于小麥白粉病菌具有高度變異性，不同地區之間的群體結構存在差異，因此加強小麥白粉病菌群體遺傳結構研究、充分利用抗病品種的有效性，可有效降低白粉病對小麥產量帶來的不利影響［4，5］。

目前國內外普遍采用一套已知抗性基因品種（系）進行小麥白粉病菌群體毒性結構監測。Parks［6］和EI-Shamy［7］等分別于2008年和2016年應用已知抗白粉病基因材料監測了2003—2005年美國東南部和2013—2014年埃及小麥白粉病菌的群體毒性結構。該技術從20世紀80年代開始，逐漸應用于我國部分?。ㄊ校┬←湴追鄄【后w的毒性監測研究中，近幾年來很多研究者采用該方法對陜西、河南、新疆、四川、山東、甘肅、黑龍江［5，8-13］等小麥主要產區白粉病菌的毒性結構開展大量研究，基本明確了各地小麥白粉病菌的毒性基因頻率和有效抗病基因組成。

小麥白粉病菌的毒性頻率是動態變化的，因此本研究采用鑒別寄主毒性監測方法［14］，對2018年山東省不同地區小麥白粉病菌的群體結構進行毒性鑒定和分析，并與2015年對山東省小麥白粉病菌的毒性監測結果［11］做比較，旨在為山東省推廣抗病品種及品種合理布局提供有力依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：于2018年5—6月小麥白粉病高發期，在山東省德州、煙臺、濟南、濟寧、聊城、臨沂6市共16個地點采集小麥白粉病葉（表1），自然晾干后，每片病葉隔離放置并于4℃保存。

鑒別寄主：共31個小麥品種，均由中國農業科學院植物保護研究所提供；濟南15為當地品種，作為感病對照（表2）。小麥白粉病菌的分離、純化和擴繁均采用濟南15。

表1 小麥白粉病菌供試菌株信息

1.2 小麥白粉病菌的毒性鑒定

將保存于4℃的小麥白粉病葉浸泡于清水中，使休眠的閉囊殼萌發。挑取萌發好的閉囊殼至噴濕小麥葉片的霧滴中，罩上帶6層紗布的玻璃罩使其在16～20℃溫度下隔離保濕培養。剪下有單孢子萌發的葉片，掃涂于1葉1心期的濟南15麥苗上隔離保濕培養，即形成單孢子菌源，擴繁一次備用，總共得到62株單孢子堆菌株。

利用31個已知抗病基因的鑒別寄主和1個感病對照（濟南15）對所有供試菌株進行毒性鑒定，分別將擴繁好的小麥白粉病菌掃涂于鑒別寄主苗上，每個菌株兩次重復，每盆10株麥苗。在16～20℃溫室中隔離培養，接種10天后調查發病程度。參考司權民等［15］的調查方法，記載接菌葉片的病情反應型，其中0、0；、1和2型為抗病反應型，3和4型為感病反應型，并計算毒性頻率。毒性頻率（%）＝毒力菌株／供試菌株×100。

1.3 數據統計及分析

根據毒性鑒定結果，將有毒性的菌株記為“1”，無毒性的記為“0”。利用統計分析軟件NTSYS pc 2.11對小麥白粉病菌群體毒性矩陣進行UPGMA聚類分析［16］。

2 結果與分析

2.1 山東省各地小麥白粉病菌株毒性鑒定

利用32個寄主對德州、煙臺、濟寧、濟南、聊城、臨沂6市供試小麥白粉病菌株分別進行毒性鑒定，結果（表2）顯示，62個菌株對濟南15的毒性頻率均為100%，除了鑒別寄主中的兩個對照（Chancellor、阿夫）和當地感病對照（濟南15），德州市小麥白粉病菌群體對12個抗性基因或組合的毒性頻率高于70%，分別為Pm1a、Pm3b、Pm3c、Pm3e、Pm3f、Pm5a、Pm7、Pm8、Pm19、Pm2＋Ta、Pm“Era”和Pm“XBD”；煙臺市有15個，比德州市多了Pm3d、Pm6（寄主名稱為Coker747）、Pm17；濟寧市有22個，比德州市多了Pm2、Pm3d、Pm4a、Pm4b、Pm5b、Pm6（寄主名稱為Coker747）、Pm6（寄主名稱為Timgalen）、Pm13、Pm2＋6和Pm4＋8；濟南市有23個，和德州市相比，除對抗性基因Pm2＋Ta低于70%外，毒性頻率高于70%的抗性基因還有Pm2、Pm3a、Pm3d、Pm4a、Pm4b、Pm5b、Pm6（寄主名稱為Coker747）、Pm6（寄主名稱為Timgalen）、Pm13、Pm17、Pm2＋6和Pm2＋Mld；聊城市除了Pm21、Pm1＋2＋9、Pm4b＋5b和Pm5＋6，臨沂市除了Pm21外，對其余抗性基因的毒性頻率均高于70%。說明這些抗性基因已失去抗性。

德州市小麥白粉病菌群體對Pm4b、Pm5b、Pm21、Pm1＋2＋9、Pm2＋6、Pm2＋Mld、Pm4＋8、Pm4b＋5b及Pm5＋6抗性基因的毒性頻率低于30%，并且對Pm4b、Pm5b、Pm21、Pm2＋6、Pm 2＋Mld、Pm4b＋5b及Pm5＋6共7個抗性基因的毒性頻率均為0；與德州市相比，煙臺市小麥白粉病菌群體對除了Pm1＋2＋9外的8個抗性基因的毒性頻率低于30%；濟寧市和濟南市相同，只對抗性基因Pm21和Pm1＋2＋9的毒性頻率低于30%；聊城市和臨沂市的小麥白粉病菌群體僅對抗性基因Pm21的毒性頻率低于30%，說明這些抗性基因在當地仍為有效基因。

2.2 小麥白粉病菌群體毒性結構

如圖1所示，除兩個鑒別寄主對照及感病對照外，62個小麥白粉病菌株對17個抗性基因或組合的毒性頻率均高于70%，分別為Pm1a、Pm3b、Pm3c、Pm3d、Pm3e、Pm3f、Pm5a、Pm6（寄主名稱為Coker747）、Pm6（寄主名稱為Timgalen）、Pm7、Pm8、Pm13、Pm17、Pm19、Pm2＋Ta、Pm“Era”和Pm“XBD”，說明這些抗性基因已失去抗性；對抗性基因Pm21、Pm4b＋5b及Pm5＋6的毒性頻率低于30%，其中對Pm21抗性基因的毒性頻率為0；對Pm2、Pm3a、Pm4a、Pm4b、Pm5b、Pm1＋2＋9、Pm2＋6、Pm2＋Mld及Pm4＋8共9個抗性基因的毒性頻率介于37.10%～66.13%。

表2 山東省各地小麥白粉病菌株毒性頻率

2.3 小麥白粉病菌株毒性多態性分析

由圖2可知，當遺傳相似系數為0.67時，小麥白粉病菌毒性聚類可劃分為兩個大組，第一大組包括德州市9個菌株及煙臺市21個菌株，另外還有濟南市2個菌株（JL1和JL2）及1個濟寧市菌株JR1；第二大組包括煙臺市其余4個菌株（YQ1、YQ2、YT1、YY3）、濟南市2個菌株（JL3和JL4）、濟寧市除了JR1外的9個菌株以及聊城、臨沂市的所有菌株。

62個小麥白粉病菌株毒性相似系數在0.67～1.00之間，說明6個市的小麥白粉病菌群體間毒性存在一定差異。聚類分析結果表明，小麥白粉病菌毒性多態性與菌株地理來源有關，德州與煙臺菌株多聚在一起，濟寧、聊城、臨沂市的菌株多聚在一起。

3 討論與結論

本研究對2018年采自山東省德州、煙臺、濟南、濟寧、聊城、臨沂6市共62個小麥白粉病菌株進行了毒性監測，與2015年的毒性監測結果［11］相比有較大變化：Pm1a、Pm4a、Pm4b、Pm17及Pm“XBD”的毒性頻率上升幅度較大，其中Pm1a、Pm17及Pm“XBD”的毒性頻率已高于80%，完全失去抗性，不能再作為抗性材料使用；Pm1＋2＋9、Pm2＋6、Pm2和Pm5b的毒性頻率有不同程度的下降，毒性頻率在38.71%～66.13%之間，這可能與近幾年山東各地區小麥主栽品種的調整有關，也可能與采樣地點的不同有一定關系，仍需要繼續監測；另外，新增的3個抗性基因Pm13、Pm2＋Ta及Pm“Era”毒性頻率均高于70%，不能作為抗性材料使用。

本研 究 表 明，Pm1a、Pm3b、Pm3c、Pm3d、Pm3e、Pm3f、Pm5a、Pm6、Pm7、Pm8、Pm13、Pm17、Pm19、Pm2＋Ta、Pm“Era”和Pm“XBD”的毒性頻率均高于70%，其中Pm1a、Pm3b、Pm3c、Pm3e、Pm3f、Pm5a、Pm7、Pm8和Pm19的毒性頻率在全國大部分地區，如河南［8］、新疆［9］、四川［10］、甘肅［12］、陜西［17］等省份均偏高，但Pm13和Pm“XBD”的毒性頻率在這些省份均偏低。李強等［5］研究表明，Pm6、Pm17、Pm“Era”的毒性頻率在陜西省均偏低，與其他人的研究結果不一致，未見有關抗性基因Pm2＋Ta的相關報道。本研究表明，Pm2、Pm3a、Pm4a、Pm4b、Pm5b、Pm1＋2＋9、Pm2＋6、Pm2＋Mld、Pm4＋8、Pm4b＋5b及Pm5＋6共11個抗性基因的毒性頻率介于29.03% ～66.13%，所有供試菌株對抗性基因Pm21的毒性頻率均為0，說明Pm21對供試小麥白粉病菌株具有極強的抗性，與許多研究者的報道一致［5，8，9，17，18］，但也應避免大面積單一種植而造成抗性喪失。

本研究比較了德州、煙臺、濟南、濟寧、聊城、臨沂6個市的小麥白粉菌群體之間的毒性頻率。結果表明，31個鑒別寄主，除了2個對照外，德州市小麥白粉病菌群體對12個抗性基因或組合的毒性頻率高于70%，同時對7個抗性基因的毒性頻率等于0，說明德州市小麥白粉病菌群體普遍毒性較弱，甚至部分鑒別寄主表現為免疫；煙臺市有15個抗性基因的毒性頻率高于70%，可以將德州市、煙臺市篩選出的有效基因結合利用，尤其一些累加基因組合，如Pm4＋8、Pm4b＋5b及Pm5＋6；濟寧市和濟南市分別有22、23個抗性基因的毒性頻率高于70%，而且兩市的所有菌株對抗性基因Pm1＋2＋9的毒性頻率均為0，這與2013年的研究結果差異較大，也與前人研究結果不盡相同［6-10］，后續仍需要密切監測；聊城市除了Pm21、Pm1＋2＋9、Pm4b＋5b和Pm5＋6，臨沂市除了Pm21外，白粉病菌群體對其余抗性基因的毒性頻率均高于70%，說明這兩市小麥白粉病菌群體毒性較強，大多數抗性基因已失去抗性，需要另外尋找抗性基因利用。

本研究對所有供試菌株進行聚類分析表明，德州市的所有菌株和煙臺市的大部分菌株聚在一起，并交錯排列，說明兩地白粉病菌株相似度比較高，但兩市地理距離比其他市更遠，其中的原因還需要加深研究；濟寧、聊城及臨沂的菌株多聚在一起，說明這3個地方的小麥白粉病菌株群體毒性較為接近。濟寧、聊城及臨沂市位于山東省西南部，氣候較為相似，為避免今后小麥白粉病菌群體間的基因交流，應避免大面積種植單一、相同的小麥品種。濟南市的白粉病菌株在兩組中均有排布，還需進一步監測。

小麥白粉病菌株群體的毒性結構隨時間、地點不同呈動態變化，利用鑒別寄主對其進行毒性監測是最直觀、最基礎的工作，需要持續進行以掌握其動態變化規律。下一步應利用SNP標記、SRAP標記等技術開展小麥白粉病菌株遺傳多樣性研究［19］。抗性基因Pm21對小麥白粉病具有廣譜抗性，建議將其與其他有效抗性基因結合利用，以豐富抗病基因的多樣性，或通過分子生物學手段揭示其抗性機制，進行Pm21基因特異性標記開發和利用，為小麥抗病育種及選擇栽培品種提供理論依據［20］。