NaCl脅迫對胡麻種子萌發、幼苗生長及Na＋／H＋逆向轉運蛋白基因表達的影響

趙東曉，董亞茹，孫景詩，耿兵，王照紅，郭洪恩，王向譽

（山東省蠶業研究所，山東 煙臺 264002）

胡麻（Linum usitatissimumL.）是亞麻科（Lianceace）亞麻屬（Linum）油用亞麻的俗稱，相較其他作物，具有較強的抗旱、抗寒、抗貧瘠能力［1］。胡麻種子含油量高，僅次于花生，是我國重要的油料作物。胡麻油富含人體必需的α-亞麻酸和亞油酸等不飽和脂肪酸，因此被譽為“陸地上的深海魚油”，是一種優質的保健食用油，具有抗心腦血管疾病等保健功能［2］。此外，胡麻籽還含有豐富的木酚素、亞麻膠、果膠、膳食性纖維和優質蛋白等多種營養成分，近年來在食品、化妝品、工業、醫藥和保健品領域被廣泛應用［3］。胡麻在我國主要分布于西北和華北等省份，是種植地區重要的經濟作物之一［4］。我國胡麻主產區一直在遭受不同程度的土壤鹽漬化危害，隨著我國鹽漬化土壤面積的不斷擴張，土壤鹽漬化已成為當前我國胡麻生產面臨的主要非生物脅迫之一，嚴重制約了胡麻產業的可持續發展［5］。因此，研究不同程度鹽脅迫對胡麻生長的影響對當前胡麻育種和生產具有重要意義。

種子萌發階段是植物生活史的起始階段，種子萌發和幼苗生長時期是植物最脆弱的階段，也是對脅迫環境最為敏感的時期［6］。種子能夠發芽并且生長，是決定植物能夠生存繁育的重要因素［7］。鹽漬化土壤主要通過過高的Na＋對植物造成滲透脅迫和離子毒害。植物為了有效抵御鹽脅迫，進化出一種Na＋／H＋逆向轉運蛋白（Na＋／H＋antiporter protein，NHX），其位于細胞質膜和液泡膜上，可以將Na＋從細胞質內轉運到細胞或液泡外或將Na＋區域化，以此維持細胞內Na＋濃度、穩定細胞的滲透勢。研究表明，NHX參與了諸多生理生化過程，如細胞增殖、調控細胞內pH值平衡、鹽應激反應、離子運輸和生長發育等，是與植物耐鹽性相關的關鍵因子［8-13］。以往已有不少纖維用亞麻在鹽脅迫下萌發和幼苗生理響應的研究［14-16］，但針對不同濃度鹽脅迫對胡麻影響的研究還鮮有報道。本研究用一定濃度的NaCl溶液對胡麻種子進行脅迫處理，調查發芽指標和幼苗生長情況，并用熒光定量PCR法檢測了不同組織中NHX的表達情況，以期為胡麻的鹽堿地栽培提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試胡麻品種為定亞17號，由中國農業科學院麻類研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子萌發與脅迫處理 挑選顆粒飽滿的胡麻種子置于75%乙醇中消毒20 min后，用無菌蒸餾水沖洗3～5次，晾干表面水分，均勻放置于鋪有3層無菌濾紙的直徑為9 cm的培養皿中，每個培養皿40粒種子。并加入10 mL濃度分別為0（CK）、50、100、150、200 mmol／L的已滅菌NaCl溶液（1／2Hoagland營養液配置），封口膜封口后，置于光照培養箱中。培養條件為25℃，光周期為光照12 h／d。每處理設3個重復。

1.2.2 發芽指標和幼苗生長指標的測定 以胚根突破種皮2 mm作為發芽標準。播種次日起每天9時統計發芽種子數，連續統計7 d。在第8 d，每個培養皿隨機挑選5株幼苗，用游標卡尺測量幼苗株高和主根長；用萬分之一天平稱量地上部分和根鮮重；然后置于50℃烘箱中烘干至恒重，用萬分之一天平稱重。

按照如下公式計算各項指標：

發芽勢（%）＝第3 d時發芽種子數／供試種子數×100 ；

發芽率（%）＝第7 d時發芽種子數／供試種子數×100 ；

發芽指數＝∑（Gt／Dt），式中Gt為發芽種子數，Dt為對應的發芽天數 ；

活力指數＝發芽指數×株高 。

1.3 NHX基因表達量的檢測

由于200 mmol／L NaCl脅迫下胡麻幼苗生長受到嚴重抑制，無法長出子葉，因此本研究利用熒光定量PCR法檢測了0、50、100、150 mmol／L NaCl脅迫下萌發第8 d胡麻幼苗葉片和根中NHX基因的相對表達情況。各處理組隨機挑選10株幼苗用無菌去離子水沖洗3次后控干表面水分，用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa公司）提取各組樣品的總RNA，用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKa-Ra公司）進行反轉錄合成cDNA第1條鏈。選用文獻報道的亞麻NHX基因［17］及亞麻β-Actin內參基因［18］的引物，引物序列見表1，由上海生工生物工程有限公司合成。利用CFX96 Real-Time Detection System進行PCR擴增，設置反應體系為20μL，其中cDNA模板2μL，2×TB Green Premix Ex Taq 10μL，10μmol／L上、下游引物各0.5μL，ddH2O 7μL。擴增程序：95℃預變性30 s；95℃5 s，60℃30 s，40個循環。根據測得的Ct值，采用2-ΔΔCt方法［19］計算目的基因NHX的相對表達量。每個樣品做3次重復。

表1 引物及引物序列

1.4 數據統計與處理

采用Microsoft Excel 2007對試驗數據進行處理，用SPSS 20.0對數據進行統計分析，不同小寫字母表示數據在P＜0.05水平下差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同濃度NaCl對胡麻種子發芽勢的影響

隨著NaCl濃度升高，胡麻種子發芽勢呈現逐漸下降的趨勢。各濃度NaCl脅迫下發芽勢與對照差異顯著。100 mmol／L以下NaCl脅迫的胡麻種子發芽勢仍在85%以上，但當NaCl濃度達到150 mmol／L后發芽勢大幅度下降，150、200 mmol／L NaCl脅迫下胡麻種子的發芽勢分別比對照下降了89.37%和98.48%（圖1）。

2.2 不同濃度NaCl對胡麻種子發芽率的影響

胡麻種子發芽率與NaCl濃度呈負相關關系，即NaCl濃度越高，發芽率越低（圖2）。NaCl脅迫濃度超過50 mmol／L后胡麻種子發芽率顯著下降，但150 mmol／L NaCl脅迫下發芽率仍能達到85%以上，說明胡麻種子有較強的耐鹽能力。

2.3 不同濃度NaCl對胡麻種子發芽指數的影響

胡麻種子發芽指數隨NaCl濃度增加逐漸降低，各濃度間均達到顯著差異。50～200 mmol／L NaCl脅迫下胡麻種子發芽指數分別為78.05、66.10、48.33和10.68，與對照相比，分別下降了16.30%、29.12%、48.17%和88.55%（圖3）。

2.4 不同濃度NaCl對胡麻種子活力指數的影響

NaCl濃度越高，胡麻種子活力指數越低。50 mmol／L NaCl處理的活力指數與對照差異不顯著，之后顯著降低，與對照相比，100～200 mmol／L NaCl脅迫下胡麻種子活力指數分別下降了53.38%、78.33%和97.71%（圖4）。

2.5 不同濃度NaCl對胡麻幼苗生長的影響

50 mmol／L NaCl處理增加了胡麻幼苗的株高和根長，且根長顯著高于其他處理。100～200 mmol／L NaCl脅迫顯著降低了胡麻幼苗的株高和根長，且濃度越高，降幅越大，與對照相比，株高分別降低了33.80%、58.24%和79.30%，根長分別降低了26.64%、53.43%和77.57%（圖5A）。

50 mmol／L NaCl脅迫時，胡麻幼苗地上部和根部鮮、干重均增加，其中地上部鮮重和干重顯著高于其他處理，根部鮮重和干重與對照差異不顯著，但顯著高于其它濃度NaCl處理。NaCl濃度達到100 mmol／L時地上部和根部干重和鮮重均顯著降低，且隨NaCl濃度升高，地上部和根部的鮮、干重均逐漸降低，且處理間差異達顯著水平（圖5 B、C）。

2.6 不同濃度NaCl對胡麻幼苗葉片和根中NHX表達量的影響

由圖6可知，胡麻幼苗葉片和根中NHX基因的相對表達量與NaCl濃度正相關。50、100、150 mmol／L NaCl脅迫下胡麻幼苗葉片和根中NHX基因的相對表達量均顯著高于CK，其中，葉中的相對表達量分別是CK的3.48、6.41、7.53倍，根中的相對表達量分別是CK的5.82、12.76、19.67倍。

3 討論與結論

種子能否迅速、整齊地萌發，幼苗能否健壯地長成，是植物在逆境中能否定植成苗的關鍵，并直接影響植物后期的生長發育和產量［20］。發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數分別反映種子的發芽能力、速度、整齊度和活力，是綜合評價種子發芽能力的重要指標［21］。鹽脅迫下種子的發芽能力與植物的抗鹽能力呈正相關關系，因此可在一定程度上反映植物的抗鹽性［22］。本研究結果表明，胡麻種子的發芽率、芽勢、發芽指數和活力指數與鹽脅迫程度負相關，但受鹽脅迫影響的程度不同。NaCl脅迫濃度在150 mmol／L時發芽率仍高于85%，而當濃度達到200 mmol／L時發芽率大幅下降至33.75%，表明胡麻種子在一定濃度鹽脅迫下仍有較強的發芽能力。發芽勢在NaCl脅迫濃度低于100 mmol／L時高于85%，150 mmol／L時急劇下降至10.50%，說明胡麻種子在100 mmol／L NaCl脅迫下仍然保持了較高的發芽速度，但NaCl濃度繼續升高發芽速度則急劇降低。發芽指數和活力指數在100 mmol／L NaCl脅迫下大幅下降，說明100 mmol／L NaCl脅迫嚴重影響了胡麻種子發芽的整齊度和活力。綜合分析各項發芽指標可見，胡麻種子具有較強的抗鹽性，在100 mmol／L NaCl脅迫下發芽能力和速度仍能保持較高的水平，但會影響發芽的整齊度和種子活力。這與郭媛等［14］的研究結果一致。

由于生長的固著性，在遭受逆境脅迫時，植物會在植株形態和生長方面產生相應的變化以適應逆境［23］。本研究中，50 mmol／L NaCl脅迫下胡麻幼苗的株高、根長及地上部和根部鮮、干重均高于對照組，說明適宜的低濃度NaCl可刺激胡麻幼苗的生長。這與于曉丹［24］、趙瑋［25］、孫海博［26］等的研究結果類似，分析原因可能是一方面一定濃度范圍的鹽離子可刺激呼吸酶的活性，另一方面，低濃度鹽脅迫可能會提升幼苗細胞膜的滲透調節作用［27］。當NaCl脅迫達到200 mmol／L時，由于嚴重的滲透脅迫和離子毒害，胡麻幼苗的生長受到嚴重抑制，并最終難以成苗。

許多研究表明，植物NHX基因有組成型表達和誘導型表達兩種形式［28］。擬南芥、大豆、水稻、玉米、茶樹、桑樹的部分NHX基因家族成員屬于組成型表達［29-31］。本研究結果顯示，NaCl脅迫下胡麻NHX基因在葉片和根中的相對表達量均顯著增加，表明在NaCl脅迫下，胡麻幼苗葉片和根中的NHX基因表達均受到顯著誘導，且NaCl脅迫濃度越高，受誘導的程度越大，這與茶樹［30］、桑樹［31］、冰葉日中花［32］、互花米草［13］等植物的研究結果一致。胡麻幼苗根部NHX基因受誘導上調的幅度較葉片更大，可能是由于胡麻幼苗根部最先受到NaCl脅迫，這與苜蓿MtNHX6基因［33］的表達模式一致。

綜上所述，胡麻種子在萌發和幼苗生長時期具有一定的耐鹽性。100 mmol／L NaCl脅迫會影響胡麻種子發芽的整齊度和活力；200 mmol／L NaCl脅迫下種子仍可萌發，但難以成苗；50 mmol／L NaCl可促進胡麻幼苗的生長。NaCl脅迫使胡麻NHX基因表達量顯著上調，根中NHX基因上調程度高于葉片。本研究對胡麻在土壤鹽漬區育種和栽培具有現實的理論指導意義。本研究僅針對胡麻萌發期和幼苗期對一定濃度NaCl脅迫的響應設計試驗，長期鹽脅迫對胡麻整個生育期的影響以及NHX基因在不同時間點的表達情況仍需要進一步探究。