山東晚熟桃的SCoT遺傳多樣性分析

李淼，李桂祥，劉偉，董曉民，高曉蘭，滕興榮，張守民，徐志芳，王孝友，張安寧

（1.山東省果樹研究所，山東 泰安 271000；2.沂源縣果品產(chǎn)銷服務(wù)中心，山東 淄博 255000；3.蒙陰縣果業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東 臨沂 276500）

桃（Amygdalus persicaL.）屬薔薇科桃屬植物，落葉小喬木，原產(chǎn)中國(guó)。山東省是全國(guó)桃主產(chǎn)區(qū)，多年來栽培面積和產(chǎn)量穩(wěn)居全國(guó)之首。桃肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛。隨著桃產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，桃品種更新替代加快，越來越多的新品種涌入市場(chǎng)，滿足并豐富果農(nóng)的選擇。但是，桃品種缺少一套科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆诸惙椒?，如何快速、?zhǔn)確對(duì)桃品種進(jìn)行有效鑒定和分類成為亟需解決的問題。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)作為鑒定作物品種的主要方法之一，在指紋圖譜構(gòu)建、遺傳關(guān)系鑒定中應(yīng)用較為成熟。SCoT（start codon targeted polymorphism）分子標(biāo)記，即目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性標(biāo)記，是一種依據(jù)植物基因中的ATG翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼序列的保守性，設(shè)計(jì)單引物并對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增的新型目的基因分子標(biāo)記技術(shù)［1］。SCoT有別于AFLP［2］、ISSR［3］、SSR［4］、RAPD［5］等傳統(tǒng)意義上的隨機(jī)分子標(biāo)記，以其成本低、引物通用性強(qiáng)、易操作和重復(fù)性好等多方面優(yōu)勢(shì)在多種作物上得到廣泛應(yīng)用，如獼猴桃［6］、柑橘［7］。

本研究采集山東桃產(chǎn)區(qū)有代表性的中晚熟桃和極晚熟桃，建立SCoT-PCR體系進(jìn)行桃遺傳多樣性分析，為桃種質(zhì)鑒定工作提供理論依據(jù)，并為果農(nóng)選擇品種時(shí)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試11個(gè)桃品種分別為秋風(fēng)蜜、金秋紅蜜、肥城桃、八月脆、寒露蜜、青州蜜桃、沂蒙霜紅、映霜紅、中華壽桃、金牛山1號(hào)和晶白桃，詳見表1。

于2019年6月18—20日采集不同桃品種成熟葉片，每種采摘10片混合均勻，用錫箔紙包裝后放入液氮，盡快帶回實(shí)驗(yàn)室于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)用桃品種詳細(xì)信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 采用CTAB法［8］提取桃葉DNA，并用NanoDrop One微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀檢測(cè)其濃度和純度，最后統(tǒng)一稀釋至30 mg／L，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SCoT引物及PCR擴(kuò)增 本試驗(yàn)所用引物均來自植物研究中已公布的SCoT引物（表2）。SCoT-PCR反應(yīng)體系（20μL）：2.5 mmol／L Mg2＋1 μL、0.3 mmol／L dNTPs 0.4μL、30 mg／L DNA模板1 μL、1.00μmol／L引物0.5μL、0.4 U Taq DNA聚合酶0.5μL、ddH2O 16.6μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，48℃30 s，72℃2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并在ChamlGelTM6000型凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照。

表2 SCoT引物序列信息

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)不同樣品同一位置電泳膠條帶有無進(jìn)行賦值，有條帶記為1，無條帶記為0，形成（0，1）矩陣。采用NTSYS pc 2.1軟件計(jì)算不同品種間的遺傳相似系數(shù)，利用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，并根據(jù)遺傳相似系數(shù)進(jìn)行主成分分析（PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCoT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

由表3可以看出，14條引物共擴(kuò)增出170條清晰、整齊的條帶，平均每條引物可擴(kuò)增12.14條。其中，多態(tài)性條帶共118條，多態(tài)性比率為50.00%～93.33%，平均多態(tài)性比率為68.43%。引物SCOT8對(duì)11個(gè)桃品種的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

表3 SCoT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 遺傳距離及其遺傳多樣性分析

根據(jù)SCoT-PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果所轉(zhuǎn)換的（0，1）矩陣表，利用NTSYS pc 2.1軟件計(jì)算各品種間的遺傳相似系數(shù)。由表4可知，11個(gè)桃品種間的遺傳相似系數(shù)在0.37～0.89之間，平均值是0.69。其中沂蒙霜紅和映霜紅、金牛山1號(hào)和青州蜜桃、金牛山1號(hào)和映霜紅間的遺傳相似系數(shù)均較大，為0.89，表明其親緣關(guān)系較近。秋風(fēng)蜜和肥城桃的遺傳相似系數(shù)最小，表明兩者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因此秋風(fēng)蜜具有肥城桃的遺傳背景的可能性較小。11個(gè)桃品種間遺傳相似系數(shù)分布0.75以上的組合有21個(gè)，占總體的38.18%，遺傳相似系數(shù)小于0.75的品種占61.82%。綜上可知，11個(gè)桃品種間的遺傳相似性較低，遺傳多樣性較高。

2.3 聚類分析和主坐標(biāo)分析

由圖2可以看出，在遺傳相似系數(shù)為0.72水平上，可以將11個(gè)桃品種分為3組。第Ⅰ組為秋風(fēng)蜜和八月脆；第Ⅱ組包括7個(gè)品種：金秋紅蜜、寒露蜜、青州蜜桃、沂蒙霜紅、映霜紅、中華壽桃、金牛山1號(hào)；第Ⅲ組包括肥城桃和晶白桃。

表4 11個(gè)桃品種間的遺傳相似系數(shù)

根據(jù)遺傳相似系數(shù)對(duì)桃品種進(jìn)行主坐標(biāo)分析，并繪制二維散點(diǎn)平面分布圖。如圖3所示，第一主坐標(biāo)和第二主坐標(biāo)分別解釋了32.85%和15.73%的品種間相關(guān)性，累計(jì)貢獻(xiàn)率為48.58%，能代表原始數(shù)據(jù)的主要信息。主坐標(biāo)分析圖中，種質(zhì)材料間的距離越近，表示親緣關(guān)系越近，反之則越遠(yuǎn)。根據(jù)種質(zhì)材料間的距離可將11份桃品種分成A、B和C三組，圖中分別用虛線圈出，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)A、B組和C組與聚類分析結(jié)果（Ⅰ、Ⅱ組和Ⅲ組）高度相似，但主坐標(biāo)分析更能直觀清楚地顯示桃品種間的親緣關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

桃品種選育和優(yōu)系創(chuàng)質(zhì)的主要方式是基于實(shí)生苗選種、自然芽變選種和雜交群體選種。由于骨干親本的重復(fù)利用，桃種質(zhì)材料的形態(tài)特征具有一定相似性，這為利用外觀形態(tài)特征進(jìn)行辨別分類帶來一定困難。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)由于其穩(wěn)定、高效、不易受外界環(huán)境影響的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于果樹遺傳學(xué)分析，如芽變材料鑒定［9］、親緣關(guān)系分析［10-12］和種內(nèi)亞群體劃分等［13］。SCoT分子標(biāo)記具有高效、重復(fù)性好、應(yīng)用性廣、簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)應(yīng)用于茶樹［14］、楊桃［15］、月季［16］、枸杞［17］、龍眼［18］、柿［19］、荔 枝［20］等 物 種 中。本 研 究 利 用SCoT標(biāo)記在桃中進(jìn)行種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)14條引物在11個(gè)桃品種上共擴(kuò)增出170條清晰、整齊的條帶，多態(tài)性水平較高（平均多態(tài)性比率為68.43%）。桃材料的遺傳相似系數(shù)在0.37～0.89之間，表明所收集的桃資源內(nèi)具有較高的遺傳多樣性。根據(jù)聚類分析和主成分分析結(jié)果，11個(gè)桃品種可分為三大類群：第一類為中熟2個(gè)品種，第二類為晚熟與極晚熟青州蜜桃群組，第三類為晚熟肥城桃群組。Ⅰ組和Ⅱ、Ⅲ組間比較發(fā)現(xiàn)，品種多樣的遺傳背景與果實(shí)的不同成熟期具有一致性，表明二者緊密相關(guān)。Ⅱ組和Ⅲ組組間比較發(fā)現(xiàn)，同為晚熟桃品種，以青州蜜桃和肥城桃為代表的地方名優(yōu)品種分組清晰明確，說明兩個(gè)組間具有成熟期之外的遺傳物質(zhì)多樣性。

因此，利用SCoT標(biāo)記對(duì)桃種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定分析是十分有效的，具有較高的多態(tài)性檢測(cè)率，適用于桃種質(zhì)資源鑒別及親緣關(guān)系分析，為桃資源的分類和種質(zhì)的創(chuàng)制提供了科學(xué)依據(jù)。