洋蔥花梗愈傷誘導及再生體系的建立

惠林沖，陳微，李威亞，潘美紅，何林玉，王江英，陳振泰，繆美華，楊海峰

（連云港市農業科學院，江蘇 連云港 222000）

洋蔥愈傷組織的誘導、再生與外植體的選擇關系密切。研究發現，洋蔥的種子［1］、成熟胚［2］、鱗莖盤［3］、胚根［4］等均可作為外植體誘導形成愈傷組織，但部分誘導出的愈傷組織不能形成再生苗。Valk等［5］認為洋蔥愈傷組織誘導受基因型影響，因此，誘導時需要對多種材料進行篩選，綜合考慮外植體類型、污染率、消毒操作難易程度等。

我國的經濟正在進入深化改革的階段，社會資源的供需矛盾正在加劇。最明顯的問題就是社會利益分配不均。由于法律制度存在滯后性，而我國的發展速度非常快，造成了法律法規的建設無法跟上社會的發展速度。普遍存在的問題是對權利的監督不完善，導致社會不公平的問題較多，影響青少年價值觀的形成。需要加快社會保障制度的完善，提高法律法規的規范化，做到有法可依和有法必依。

洋蔥種子易保存，但存在種子污染率較高、后期需要轉接胚以及操作繁瑣且不適宜大規模篩選操作等問題。目前，中國水仙［6］、石蒜［7］、桂花［8］、文心蘭［9］等花卉植物的花梗經誘導均可形成愈傷組織，而洋蔥的小花梗多且易取，消毒方便、污染率低。因此，本試驗選取8個洋蔥品種，用其花梗進行愈傷組織誘導及再生研究，以期為構建洋蔥遺傳轉化體系和基因編輯技術研究奠定基礎。

2012年8月31日第十一屆全國人民代表大會常務委員會第二十八次會議通過了《關于修改〈中華人民共和國民事訴訟法〉的決定》，該修改決定首次在簡易程序章節中以法律形式規定了我國的民事小額訴訟制度，其意義極為重大。然而，因為立法對小額訴訟制度只作了簡單的規定，所以導致不同人對小額訴訟有不同的解讀，小額訴訟制度的多義性在學理上有其合理性，但在實踐中卻不利于其統一實施。基于此，本文擬通過對小額訴訟程序性質的解讀，為小額訴訟制度的具體規范提供一些前提性的資源。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗選用中日照洋蔥品種（表1），均種植于連云港市農業科學院東辛試驗基地。于洋蔥先期抽薹時取未開裂花苞，裝入密封袋中4℃保存備用。

表1 供試洋蔥品種詳細信息

1.2 花梗愈傷組織誘導

醫院要完善新醫改下的精細化管理工作，就需要有力的財經管理部門作為支撐，按照《醫院財務制度》，實施全面預算管理，著力成本控制，有效防范風險，達成綜合績效目標，使財務工作實現閉環式管理。通過建立管理會計制度，促進醫院財務精細化，科學化管理，優化流程，提升組織效率。但是，在這個階段，醫院財務人員的整體規模不足。這表明在推進管理會計的過程中，管理型人才實力就更加緊缺。

1.3 愈傷組織繼代培養及再生苗誘導

將誘導出的洋蔥苗在再生培養基（MS＋30 g／L蔗糖＋8 g／L瓊脂）中生根，待基部鱗莖達0.5 cm，于4℃放置24 h。用清水清洗根部培養基（根部不離水）后移栽到花盆中，室內（散射光照射）放置3 d后移至室外生長，期間防止陽光直射。

1.4 馴化移栽

將誘導得到的愈傷組織繼代培養基（MS＋1.8 mg／L 2，4-D ＋30 g／L蔗糖＋8 g／L瓊脂）培養4周后轉接至無激素的培養基（MS＋30 g／L蔗糖＋8 g／L瓊脂）上，每品種轉接80瓶，每瓶5個愈傷。在光照強度為50μmol／（m2·s）、光周期16 h／d、25℃條件下培養120 d后，統計再生芽的數量，計算再生頻率。再生頻率＝再生苗數量／愈傷組織總數。

將花苞用自來水沖洗10 min，去除最外層花苞，同時去除花朵，只留花梗。用75%酒精浸泡花梗30 s，無菌水沖洗兩次，2%次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水沖洗兩次，后用無菌濾紙吸干多余水分。將花梗切碎放入盛有25 mL誘導培養基（MS＋1.8 mg／L 2，4-D＋2.0 mg／L甘氨酸＋700 mg／L脯氨酸＋1.0 g／L干酪素水解物＋30 g／L蔗糖＋8 g／L瓊脂）的培養皿（直徑為9 cm）中，每品種接種20皿，置于黑暗、25℃下培養。

2 結果與分析

2.1 洋蔥花梗愈傷組織誘導分析

切碎的花梗培養3～4 d后，兩端開始形成愈傷組織并逐步生長變大，顏色呈淡黃色（圖1A）。待其長至米粒大小時轉入新培養基中進行繼代培養，8個品種不受基因型影響，均能誘導出愈傷組織，誘導率為100%（圖1B）。

2.2 洋蔥愈傷組織再生苗誘導分析

由表2可以看出，8個品種中1803再生頻率最高，達30%，其它品種不足10%；1833、1864和1868的愈傷組織未誘導成苗，呈白灰色、發軟，未見新根誘導及生長跡象。因此，洋蔥再生頻率與愈傷組織外植體基因型有關。

經誘導，洋蔥愈傷組織開始生根，但不同品種間生根快慢和多少存在差異。培養60 d后，大部分愈傷組織呈干枯狀（圖2A、2B）；較大的愈傷組織上綠色原基開始突出，慢慢長出畸形管狀葉（圖2B、2C），隨后萌發出多個管狀葉，形成植株（圖2D）。洋蔥苗于鱗莖基部生根，長苗和生根同步進行，長出的根比原愈傷組織的粗壯、長且長速快（圖2E、2F）。

表2 洋蔥愈傷組織再生苗數統計

2.3 洋蔥愈傷組織再生苗移栽結果

誘導洋蔥苗移栽后的生長情況如圖3所示，移栽成活率為90%。但葉片過細和數量少時不宜移栽，可在組培瓶中多生長一段時間。

時值冬季，天氣逐漸寒冷，寶寶稍不注意“小肚子”就會著涼，尤其是年齡較小的寶寶，拉起肚子來往往讓寶媽們措手不及又心疼不已。

3 討論與結論

目前，國內外少有采用洋蔥花梗作為外植體進行愈傷組織誘導的報道，大部分研究集中于種子、成熟胚、莖尖等外植體，而在園藝花卉植物中利用花梗進行愈傷誘導較為普遍。鐘瑞潔［10］對‘新發中秋花’萱草進行組織培養研究發現，其幼嫩花梗分蘗結節處為最適宜外植體。張夢迪［11］以朱頂紅‘Blossom Peacock’和‘Royal Velvet’花梗為外植體進行試驗，發現其在光照、培養基為MS＋0.5 mg／L萘乙酸（NAA）＋2.0 mg／L噻苯隆（TDZ）上的愈傷誘導率分別達到37.50%、29.17%。陳菁玨［12］認為花梗是石蒜花愈傷誘導的最佳外植體。張杰等［13］也認為百合花器官中花絲易誘導形成愈傷組織，花梗易誘導成不定芽。基于此，本研究對8個洋蔥品種花梗進行愈傷誘導，發現其均能形成愈傷組織，誘導率高達100%。花梗為果實或種子提供營養的必經通道，運輸營養物質和代謝激素，尤其是離體培養后相關基因調控激素代謝表達。Fu等［14］對番茄花梗脫落過程的研究發現，水解植物生長素結合物調節生長素濃度，SlILR1、5、6基因在花梗脫落中起關鍵作用。本試驗認為，將花梗放入培養基中培養，較長的花梗會在培養基中繼續生長，且花梗中存在調控生長相關激素，能夠促進愈傷萌發。

本研究中8個品種均能100%誘導形成愈傷組織，但3個品種未誘導成苗，僅1803品種再生頻率最高，為30%，其它4個品種的再生頻率非常低。本團隊前期研究發現，洋蔥其它外植體也能經誘導形成愈傷，但在各種激素或無激素培養基上均未誘導成苗，且45 d后愈傷組織開始干枯、由淡黃變灰白色，50 d后枯死。本研究中愈傷組織生長較慢，因放假等原因超50 d未繼代處理，60 d后開始有綠色原基出現，2～3個月才有洋蔥苗長出，120 d后未誘導成苗的愈傷組織發軟或表面干枯。

研究發現，洋蔥胚芽（莖尖）誘導形成的愈傷組織在MS＋1.5 mg／L 6-BA＋2 mg／L甘氨酸和MS＋1 mg／L TDZ＋0.5 mg／L NAA＋7.5 mg／L AgNO3培 養基 上 再 生 頻 率 分 別 達78%［15］、82%［16］，在MS＋30 g／L蔗糖和BDS（改良B5培養基）＋30 g／L蔗糖培養基上再生頻率分別達到44%和80%［17，18］。本研究中洋蔥花梗愈傷組織在無激素培養基上能夠誘導再生苗，再生頻率為30%。另有研究發現，低溫處理改變水稻花藥壁的多糖和蛋白質組成，并增加花粉的繁殖力和愈傷組織的誘導率；低溫預培養提高了雪蓮愈傷組織的存活率和再生能力［19，20］。洋蔥苗生長發芽以及春化均需要較低的溫度，低溫可能會促進其愈傷再生頻率，下一步將研究低溫處理是否有利于洋蔥再生頻率的提高。