HBV感染免疫耐受期產婦與正常產婦臍帶血漿細胞樣樹突狀細胞中PI3K、mTOR、p70S6K、IFNα的表達情況分析

楊雯珺， 霍 燚， 彭建平

1 湖南中醫藥大學， 長沙 410007； 2 湖南中醫藥大學第一附屬醫院 肝病科， 長沙 410007

據世界衛生組織報道，截至2017年，全世界約有2.57億慢性HBV感染者[1]。乙型肝炎仍是世界及我國的一項重大傳染病，HBV感染者常因進展為肝癌、重型肝炎及肝硬化失代償期并發癥死亡[2]。研究發現，妊娠期間免疫活性的改變會影響乙型肝炎的自然史，包括增加乙型肝炎發作的風險。據報道[3]，HBV慢性感染的婦女在妊娠期間乙型肝炎發作的流行率為6%～14%。慢性乙型肝炎相關的妊娠期糖尿病、產前出血、早產等均有報道[4]。與其他導致肝硬化的原因相似，乙型肝炎肝硬化確實增加了母親和胎兒的死亡風險[5]。因此防治乙型肝炎仍是一項重要的工作。機體免疫應答功能的損害及HBV cccDNA在肝細胞核內潛伏是導致乙型肝炎慢性化及難以根治的重要原因[6-7]。研究[8]顯示，核苷酸類似物聯合序貫PEG-IFN治療能提高HBsAg陰轉率，提示提高機體的免疫調節功能可以增強清除HBV的能力。漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cells, pDC)是一種重要的免疫細胞，通過產生大量IFN及抗原遞呈誘導適應性免疫應答抗病毒[9]。有實驗[10]證實：PI3K-mTOR-p70S6K信號通路是pDC 產生Ⅰ型IFN的關鍵調節通路。在此背景下，本實驗比較了乙型肝炎免疫耐受期產婦與正常產婦pDC中PI3K、mTOR、p70S6K及培養上清IFNα表達情況。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取湖南中醫藥大學第一附屬醫院產科住院部2017年10月-2020年1月健康產婦10例(正常組)及HBV感染免疫耐受期產婦臍帶血20例(足月產產婦)(乙型肝炎組)，診斷標準參照《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[11]。排除：(1)合并其他肝臟疾病、肝硬化、重型肝炎的患者；(2)合并HIV感染者；(3)合并糖尿病、冠心病、高血壓、惡性腫瘤等其他心、腦、腎、肺慢性疾??；(4)合并免疫性疾病及使用免疫抑制劑治療者。

1.2 主要試劑 淋巴細胞分離液(天津灝洋公司)，PBS、RPMI-1640(Thermo公司)，Recombinant Human IL-3、Flt3-L(peprotech，catalog#:200-03、300-19)，BDCA-2-PE、CD123-FITC、BDA-4-APC及同型對照抗體(德國Miltenyi Biotec公司)，CpG-A(5′-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3′，上海生物工程有限公司)，Trizol(ambion，15596026)，SYBR Green PCR試劑盒(KAPA Biosystems，KM4101)，逆轉錄試劑盒(TAKARA，639505)，DNaseⅠ(Fermentas，AM2295)，DEPC處理水(bioswamp,RN1680)，引物由武漢天一輝遠有限公司合成，人IFNα ELISA試劑盒(Bioswamp,HM10251)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 臍帶血pDC的體外培養及鑒定 按照已建立的體外分離培養臍帶血pDC的方法進行培養及鑒定[12]。在培養的第7天加入CpG-A，24 h后分別收集細胞及上清液，分組標記，進行后續相應的mRNA、蛋白及INFα檢測。

1.3.2 real-time PCR檢測pDC中PI3K、mTOR、p70S6K mRNA定量 引物序列見表1。收集第8天的pDC，用Trizol提取pDC總mRNA，用DNase1消除總RNA中的DNA，根據逆轉錄盒說明合成cDNA單鏈模板，然后進行PCR擴增，擴增體系：SYBRGreen mix 10 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O 8 μl，總體積20 μl。反應程序：95 ℃，3 min；95 ℃，5 s；56 ℃，10 s；72 ℃，25 s；39個循環；65 ℃，5 s；95 ℃，50 s。以β-actin為內參，用2-△△CT公式計算mRNA相對表達定量。

表1 引物序列表

1.3.3 Western Blot檢測pDC中PI3K、mTOR、p70S6K 蛋白定量 配備溶液制膠，在pDC中加入蛋白酶及磷酸酶抑制劑的裂解液裂解細胞，加熱，離心棄上清，提取出pDC總蛋白，定量蛋白，上樣，電泳，轉膜，封閉膜，抗體孵育，顯色。使用軟件測量蛋白條帶灰度值。

1.3.4 ELISA法檢測培養液上清的IFNα 按照ELISA試劑說明書操作測定上清中的IFNα，根據標準物濃度與OD值得出直線方程，根據每個樣本OD值計算出樣本IFNα的濃度。

1.4 倫理學審查 本研究方案經由湖南中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會審批(批號：AF/SC-07/02.0)。

2 結果

2.1 臍帶血pDC流式細胞儀檢測結果 細胞表面分子CD123、CD303、CD304均表達陽性的細胞為pDC，占17.22%，結果見圖1。

2.2 兩組pDC中PI3K、mTOR、p70S6K mRNA表達情況

與正常組比較，乙型肝炎組臍帶血pDC PI3K、mTOR、p70S6K mRNA表達水平顯著降低(P值均<0.001)(表2)。

表2 兩組產婦臍帶血pDC中PI3K、mTOR、p70S6K mRNA相對表達量

2.3 兩組pDC中PI3K、mTOR、p70S6K 蛋白表達情況與正常組比較，乙型肝炎組臍帶血pDC PI3K、mTOR、p70S6K 蛋白表達水平顯著降低(P值均<0.05)(表3，圖2)。

2.4 兩組培養液上清IFNα表達情況 正常產婦與HBV感染免疫耐受期產婦臍帶血pDC培養上清IFNα分別為(12 663.06±1286.96)pg/ml、(6069.77±953.23)pg/ml，與正常產婦比較，HBV感染免疫耐受期產婦臍帶血pDC 培養上清IFNα表達水平顯著降低(t=-15.88，P<0.05)。

表3 兩組產婦臍帶血pDC中PI3K、mTOR、p70S6K蛋白相對表達量

3 討論

近年來在HBV研究中，pDC受到重視，pDC產生體內95%左右的Ⅰ型IFN，pDC通過Toll樣受體(TLR)9識別病毒，由包含髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)、PI3K、mTOR、p70S6K、IFN調節因子(interferon regulatory factor，IRF) 7等分子的通路產生大量Ⅰ型IFN[9-10]，IFN通過誘導細胞合成的抗病毒蛋白抑制病毒復制，并調節NK細胞、DC、輔助性T淋巴細胞、B淋巴細胞等抗病毒[13]，同時，pDC還作為抗原遞呈細胞，活化B淋巴細胞及效應T淋巴細胞，激活體液免疫及細胞免疫抗病毒[9]，研究[14-15]表明在多種慢性病毒感染性疾病，包括急慢性HBV感染，患者外周血pDC數量減少、功能亦受損。有實驗[16]證實，HBV能抑制TLR9-IRF7-IFNα信號通路，從而抑制pDC分泌IFNα，從而逃逸機體的免疫應答，導致HBV持續的慢性感染。pDC功能受損是乙型肝炎慢性化的重要原因之一。

PI3K-mTOR-p70S6K信號通路參與了多種重要的細胞生理功能,該途徑的異常能導致惡性腫瘤、免疫性疾病、病毒感染不能清除等[17-18]。研究[19]發現，抑制HepG2細胞的PI3K-Akt-mTOR通路，促進HBV的復制。Cao等[10]研究顯示TLR9介導的pDC產生IFN的過程需要PI3K-mTOR-p70S6K信號通路參與，抑制mTOR及p70S6K導致IFNα減少。國內外關于HBV影響PI3K-mTOR-p70S6K通路亦有類似報道。HBV治療性疫苗-可溶性CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白疫苗降低CD8+T淋巴細胞的凋亡，增強CD8+T淋巴細胞的反應，并誘導HLA-A2轉基因小鼠的細胞免疫功能，研究[20]表明，該疫苗實現以上功能亦是通過PI3K-mTOR-p70S6K通路的激活實現的。

新生兒臍帶血DC是研究免疫耐受較好的細胞模型。研究[21]發現，健康胎兒臍血DC功能明顯下降，其原因為自然產生免疫耐受，防止對胚胎的免疫排斥反應；孕婦分娩時臍帶血pDC及mDC百分比較健康人外周血明顯下降。推測妊娠期間DC數量的減少在維持針對胚胎的免疫耐受中起著重要作用[22]。還有研究[23]表明，臍帶血DC特異性表面分子、基因和蛋白的表達明顯降低，這可能導致臍帶血DC誘導的CD8+T淋巴細胞活化的細胞表面信號轉導缺乏啟動因素。臍帶血DC中表達顯著降低的基因和蛋白也可能與先天性和適應性免疫功能和特性有關[23]。故本研究以HBV感染免疫耐受期產婦臍帶血pDC為研究對象，能更好地反映機體感染HBV后的免疫耐受狀態。

關于HBV感染免疫耐受期產婦臍帶血pDC PI3K、mTOR、p70S6K及IFNα表達的變化，目前國內外尚未見相關研究。本研究比較HBV感染免疫耐受期產婦臍帶血與健康產婦臍帶血pDC PI3K、mTOR、p70S6K及IFNα表達的變化，進一步闡述HBV感染免疫耐受的機制。本研究發現，HBV感染免疫耐受期產婦臍帶血pDC中PI3K、mTOR、p70S6K mRNA和蛋白表達水平及培養上清IFNα水平較正常產婦明顯下降，提示pDC功能低下，是乙型肝炎慢性化的可能原因之一。分析可能的原因：(1)HBV和HBsAg抑制PI3K-mTOR-p70S6K信號通路中p70S6k磷酸化，進而抑制IRF7磷酸化和IFNα基因轉錄。有學者[24]通過體外培養pDC，用HBV和HBsAg體外干預，發現HBV和HBsAg阻斷了CpG-A/TLR9誘導的、mTOR介導的S6磷酸化以及隨后的IRF7磷酸化和IFNα基因轉錄，導致pDC產生IFNα功能受抑制。(2)HBV導致TLR9-MyD88復合物的損害，進而導致IRF7的磷酸化及核轉位中斷[10]。(3)除了HBV對pDC的直接影響外，HBV也能干擾pDC與單核細胞的相互作用,間接影響pDC產生IFNα的功能[24]。HBV感染介導pDC產生IFNα的過程涉及復雜的信號通路，該實驗僅觀察了較為重要的PI3K、mTOR、p70S6K指標，信號通路中的其他分子如Akt、PIP3、PDK-1、PTEN、TSC1、TSC2、mTORC1、mTORC2、eIF-4E等及各種分子相互間作用有待進一步研究。