細胞焦亡在急性胰腺炎發病機制中的作用

韋碧薇， 龔雅慧， 梁志海

廣西醫科大學第一附屬醫院 消化內科一病區， 南寧 530021

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是多種病因導致胰酶在胰腺內被激活后引起胰腺組織自身消化、水腫、出血甚至壞死的炎癥反應，其發病率逐年增加，發生率也隨年齡的增長而增加[1]。20%～30%的AP患者可進展為重癥急性胰腺炎(server acute pancreatitis, SAP)，SAP的病死率高達30%[2]。傳統的“酶異常激活”和“自身消化學說”未能完全闡明AP的發病機制。目前的研究認為炎性因子反應、微循環障礙、氧化應激反應、腸道細菌移位等均參與了AP的發病過程。隨著研究的深入，發現胰腺腺泡細胞損傷和死亡方式決定了AP的進展和預后，因此了解AP發病早期胰腺腺泡細胞死亡方式可對發病機制、診斷和治療提供新的理論基礎。細胞凋亡和壞死是AP中胰腺腺泡細胞兩種主要的死亡方式，在病理刺激下胰腺腺泡細胞從壞死向凋亡轉變可以降低AP的嚴重程度，產生有利影響[3]。除這兩種細胞死亡方式外，新近的研究表明，細胞焦亡與AP的發生發展亦密切相關，細胞焦亡作為其中一種可促炎性反應的細胞死亡方式，是依賴于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)活性的細胞程序性死亡。目前大量研究[4-6]證實，細胞焦亡參與了感染性疾病、免疫性疾病、腫瘤等諸多疾病的發生，并發揮重要作用。細胞焦亡通過活化核因子-κB(NF-κB)通路誘導炎性小體激活，以及切割GSDMD(gasdermin D)釋放效應分子，引起急性炎癥反應[7]。炎性小體的激活和釋放效應分子對AP的全身免疫應答和適應性免疫系統的激活至關重要，是AP中胰腺及胰腺外器官損傷的重要決定因素[8-9]。本文就細胞焦亡在AP發病機制中的作用研究進展作一綜述。

1 細胞焦亡與AP發病機制的關系

細胞焦亡不同于細胞凋亡、自噬、壞死等其他細胞死亡方式，焦亡需要炎癥性的Caspase參與。細胞焦亡時，細胞發生腫脹，細胞上形成氣泡狀突出物，膜上形成眾多1～2 nm孔隙，隨后細胞膜發生破裂，大量胞質內容物釋放，誘發炎癥反應，形態學上出現細胞核濃縮，DNA斷裂等改變[10-11]。細胞焦亡在生理上可以清除細胞內病原體，抵御病原體感染，保護機體[12]；還可以通過快速的質膜破裂將細胞內的病原體驅逐并暴露于細胞外，成為免疫效應機制的目標。同時，焦亡可使受感染細胞釋放出炎性細胞因子和危險信號，將更多的免疫細胞吸引至感染部位，從而有助于消滅病原體，維持機體免疫平衡。但是，與過度炎癥反應相似，當過多的宿主細胞發生焦亡時，則可能由于細胞內炎性因子的過度釋放或宿主細胞的過度破壞而對機體產生有害影響[13]，導致疾病加重。細胞焦亡激活通路可分為依賴Caspase-1的經典途徑與依賴Caspase-4/5/11的非經典途徑。

1.1 細胞焦亡的激活機制 細胞焦亡的經典途徑依賴于Caspase-1，通過細胞膜表面的模式識別受體識別病原體相關分子模式或損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns, DAMP)后，在接頭蛋白凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein, ASC)的胱天蛋白酶募集域(Caspase recruitment domain, CARD)的相互作用下組裝和激活炎性小體，募集Caspase-1前體(pro-Caspase-1)[13]，繼而促進Caspase-1的活化并釋放。活化的Caspase-1將IL-1β前體和IL-18前體轉化為成熟的IL-1β和IL-18[14]。Caspase-1還可以切割GSDMD，分泌到細胞外，募集更多的炎癥細胞，擴大炎癥反應。

除了上述經典途徑，不依賴于Caspase-1的非經典途徑同樣發揮著重要作用。鼠源性Caspase-11和人源性Caspase-4/5是同源蛋白，Caspase-11直接識別脂多糖，通過Caspase-11的CARD與脂多糖結合后，促使其寡聚和活化[15]。活化的Caspase-11也可以切割GSDMD，形成具有打孔功能的N端，使細胞破裂，誘導細胞焦亡。同時Caspase-11通過間接參與NOD樣受體蛋白3(nod-like-receptor protein 3, NLRP3)炎性小體的形成進而誘導pro-Caspase-1激活，促進促炎性細胞因子IL-1β和IL-18的成熟[14]。這種依賴于Caspase-4/5/11的細胞焦亡方式稱為非經典細胞焦亡途徑。

1.2 細胞焦亡的關鍵蛋白——GSDMD GSDMD是gasdermin家族的胞漿蛋白，由487個氨基酸構成，全長53 kD，可廣泛表達于各種組織與細胞[16]。GSDMD作為Caspase-1/4/5/11的共同底物，是細胞焦亡中的執行者。

經典或非經典途徑中的Caspase-1/4/5/11在Asp276位點上對GSDMD進行切割，裂解后的GSDMD釋放出2個結構域，即gasdermin-N和gasdermin-C。N端片段與質膜相結合，在質膜上形成10～15 nm的gasdermin孔隙。這些孔隙的形成被認為是細胞膜上電化學梯度改變所造成，導致無法維持細胞滲透壓平衡和穩定細胞體積，最終造成細胞破裂[17]，但值得關注的是，即使在沒有發生細胞裂解的情況下，巨噬細胞和樹突狀細胞亦能夠以GSDMD依賴的方式釋放IL-1β和IL-18[18]。

1.3 細胞焦亡在AP發病機制中的作用 Caspase-1和Caspase-11的激活可促進AP炎癥反應并加重胰腺損傷。Rau等[19]對AP大鼠模型注射Caspase-1抑制劑后，發現在AP發病早期IL-1β水平、胰腺壞死程度以及病死率均顯著降低。在巨噬細胞中，當內質網功能嚴重受損引起內質網應激時，活化的內質網源性轉錄因子(C/EBP-homologous protein, CHOP)使pro-Caspase-11發生自身溶解，誘導Caspase-11和IL-1β激活，CHOP-Caspase-11通路在動物實驗[20]中也被認為參與了AP的發病機制。此外，有研究[21]指出，敲除Caspase-1與Caspase-11的小鼠較敲除NLRP3或ASC的小鼠對AP有更好的保護作用，這可能與相關的細胞焦亡途徑被抑制后，胰腺腺泡細胞破壞、促炎細胞因子釋放減少有關。

2 細胞焦亡的相關分子與AP發病機制的關系

2.1 炎性小體與AP 大部分炎性小體是由NOD樣受體或黑色素瘤缺乏因子2樣受體蛋白家族、ASC、pro-Caspase-1結合組成的多蛋白復合體。炎性小體可以識別來自宿主細胞胞質的威脅，是檢測細胞內抗原和DAMP的傳感器。其組裝激活后募集pro-Caspase-1，將其裂解成Caspase-1[22]，并將信號傳導給下游GSDMD蛋白，最終實現細胞焦亡。因此，細胞焦亡的過程中需要炎性小體參與，炎性小體的激活是細胞發生焦亡的關鍵。與細胞焦亡相關的炎性小體主要包括NLRP1、NLPR3、NLRC4、黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma, AIM2)和Pyrin[23]。目前發現與AP發病機制有關的炎性小體主要是NLRP3和AIM2。

2.1.1 NOD樣受體蛋白3(NLRP3) NLRP3屬于NOD受體蛋白家族，NLRP3炎性小體由NLRP3蛋白、ASC和pro-Caspase-1組成。當AP發生時，胰蛋白酶激活后引起胰腺腺泡細胞自身消化[24]，免疫細胞中Toll樣受體(TLR)4和TLR9以及胰腺腺泡細胞中NOD1可以識別壞死腺泡細胞釋放的三磷酸腺苷、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和游離脂肪酸在內的多種刺激，通過受體P2X7激活NLRP3炎性小體[25-26]。缺乏P2X7基因可以減少AP動物模型的胰腺損傷和炎癥反應[21]。另一方面，在應激條件下，機體生成活性氧(ROS)增加，硫氧還蛋白互作蛋白與NLRP3結合，促進炎性小體的激活[27-28]。Ren等[29]研究證明，胰腺腺泡細胞內的ROS會加重AP嚴重程度，清除ROS時能減少NLRP3炎性小體的激活，進而減輕胰腺損傷。除胰腺自身損傷外，NLRP3炎性小體還參與了胰外臟器的損傷機制[30]。Jin等[31]研究發現通過減少ROS的產生和抑制NLRP3炎性小體的激活，可以減輕胰腺和肺損傷的嚴重程度。Xu等[32]在SAP大鼠模型中，還發現NLRP3可能通過Caspase-1途徑參與了腸損傷，導致腸屏障功能受損。

2.1.2 黑色素瘤缺乏因子2(AIM2) AIM2的C端HIN200結構域可以識別病毒DNA和細菌雙鏈DNA，與ASC結合形成AIM2/ASC/pro-Caspase-1復合體，即AIM2炎性小體。臨床研究表明，AP患者的全身炎癥狀態與外周血單個核細胞介導的AIM2表達及AIM2介導的IL-1β產生存在相關性。在AP早期過程中AIM2炎性小體的激活和表達增加，提示AIM2的激活不僅可以促進局部胰腺炎癥，也可以促進AP全身性炎癥和多器官衰竭[33]。然而AIM2在AP發病過程中的機制尚未闡明，有研究[34]發現可能與核小體有關。因為胰腺損傷后可釋放出核小體，它是由DNA和組蛋白組成的復合物，是感染和無菌性炎癥環境中常見的疾病預后標志物，其可導致機體全身炎癥反應加重。另外，體外研究[35]還發現晚期糖基化終產物受體(receptor of advanced glycation endproducts, RAGE)在調節核小體復合物中DNA/高遷移率組蛋白1(high mobility group box1, HMGB1)的攝取方面起著重要作用：核小體激活RAGE后，使雙鏈RNA依賴蛋白激酶磷酸化，通過核小體-RAGE-AIM2炎性小體通路，激活AIM2炎性小體和釋放促炎因子IL-1β、HMGB1來促進AP發展。

2.2 效應分子與AP 細胞焦亡發生后，細胞釋放出的效應分子主要為IL-1β和IL-18，二者均是典型的IL-1家族成員。IL-1是驅動炎癥反應的主要因素，可引起發熱，激活免疫細胞，發揮抗微生物和促炎作用。IL-1在感染環境中起保護性作用，但當它以不受控制的方式產生時，會導致各種自身炎癥性疾病發生病理變化[36]。IL-1β被認為是AP無菌性炎癥和損傷反應的主要決定因素。IL-1β受體拮抗劑對IL-1β信號的抑制可減少胰腺炎癥和胰腺組織損傷[37]。IL-18參與輔助性T淋巴細胞(Th)1和Th2免疫反應，并參與自然殺傷細胞和巨噬細胞的活化，在不同的病理中發揮一定的作用。IL-18可誘導IFNγ的產生，而IFNγ是抗病毒和抗菌免疫的重要介質。與IL-1β類似，IL-18也可促進與IFNγ相關的疾病發生病理變化[38]。血清IL-18水平與AP的嚴重程度密切相關，可以作為早期潛在的預測指標。此外，IL-18升高通過激活Th2反應加重AP，并參與AP相關的肺損傷[39]。

另一方面，細胞焦亡的關鍵蛋白GSDMD除了影響細胞焦亡、釋放IL外，還可以促使細胞釋放HMGB1。有研究[21,40]表明HMGB1作為主要內源性TLR4配體，分別通過TLR4和核酸TLR(如TLR9)誘導和增強AP的無菌性炎癥反應，抑制HMGB1的釋放或細胞因子活性，也可對AP動物模型產生保護作用。在AP患者中，血清HMGB1水平顯著升高，并與疾病的嚴重程度呈正相關[41]。

以上細胞焦亡的相關分子，包括促炎因子IL-1β、IL-18和HMGB1，它們與AP炎癥反應程度、胰腺實質細胞損傷和疾病進程均密切相關。

3 小結與展望

細胞焦亡是受多基因調控的細胞程序性死亡，在免疫和疾病中起著重要作用。經典途徑和非經典途徑分別通過Caspase-1和Caspase-4/5/11介導激活，切割下游關鍵蛋白GSDMD，誘導細胞焦亡。細胞焦亡與代謝物受體、炎性小體激活、炎性因子之間的多種聯系密不可分，既往研究已經表明這些激活途徑及其發生過程中釋放的分子與AP發病機制密切相關。但是，仍有許多細胞焦亡的相關機制需要進一步探索，如：除NLRP3、AIM2以外其他NOD樣受體與AP的關系、溶酶體破壞激活NLRP3炎性小體途徑與AP的關系、胰腺內溶酶體降解等防御機制是否能有效對抗壞死作用、代謝物受體能否通過細胞焦亡通路抑制AP的組織損傷等。進一步探究細胞焦亡的調控機制，可能為AP的治療提供新的靶點和理論依據。