乙型/丙型肝炎肝硬化患者外周血清鞘脂表達譜特征分析

王 揚， 鐵 偲， 劉 霜， 陳 煜， 段鐘平， 鄭素軍， 張金蘭

1 首都醫科大學附屬北京佑安醫院 疑難肝病與人工肝中心， 北京 100069 2 協和醫科大學中國醫學科學院 藥物研究所， 北京 100050

病毒性肝炎是全球性的公共衛生問題，其中HBV和HCV在亞洲地區是肝硬化和肝癌的重要病因[1]。越來越多的證據[2-5]表明，鞘脂代謝物在病毒性肝炎、肝硬化及肝細胞癌等諸多肝臟相關疾病中有獨特的代謝物表達譜，并參與疾病的病理生理過程，其中可能蘊含著此類疾病的新型治療策略。在本研究中，擬探索病毒性肝炎肝硬化與非病毒性肝硬化患者外周血清鞘脂表達譜的不同。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2014年7月-2015年5月首都醫科大學附屬北京佑安醫院疑難肝病及人工肝中心收治的104例肝硬化患者為研究對象，其中病毒性肝炎肝硬化66例，非病毒性肝硬化患者31例，另病因未明肝硬化患者7例未納入本研究。

入選標準：影像學、生化或血液學檢查有肝細胞合成功能障礙或門靜脈高壓癥(如脾功能亢進及食管胃底靜脈曲張)證據，或組織學符合肝硬化診斷(例如Metavir評分=4或Ishak纖維化評分≥5)，或FibroScan檢測結果>17.5 kPa。排除標準：經影像學或肝穿刺病理檢查診斷為肝癌患者；合并嚴重的其他疾病，包括未被控制的原發性腎臟、心臟、肺臟、血管性、神經性、消化性、代謝性疾病(明顯甲狀腺功能亢進、嚴重糖尿病和腎上腺疾病)；脂質代謝異常，如嚴重高脂血癥、脂質貯積病、肥胖癥(BMI≥30 kg/m2)、免疫缺陷病或合并其他系統腫瘤等；妊娠或哺乳期。

1.2 血液生化指標及血清鞘脂檢測 肝功能、生化等檢測由首都醫科大學附屬北京佑安醫院檢驗中心完成，使用自動生化檢測器(AU640生化分析儀，OLYMPUS，日本)進行ALT和AST等生化指標的測定。血清AFP檢測使用自動電化學發光免疫分析法(羅氏診斷,上海)。血清鞘脂的檢測由中國醫學科學院藥物研究所完成，采用高效液相色譜與串聯質譜法，Agilent 6410B Triple Quad質譜儀購自安捷倫科技有限公司，其中包含了配備Agilent 1200 RRLC系統的三級四級質譜儀(Agilent Technologies Inc., Santa Clara, 美國)。共檢測57種鞘脂的表達，包括12種神經酰胺(Ceramide)、5種二氫神經酰胺(dihydroCeramide)、16種神經酰胺-1-磷酸(Ceramide-1-phosphate)、14種糖化神經酰胺(Hexosylceramide)、1種二氫鞘氨醇(dihydroSphingosine)、1種二氫鞘氨醇-1-磷酸(dihydroSphingosine-1-phosphate)、5種二氫神經酰胺-1-磷酸(dihydroCeramide-1-phosphate)、1種鞘氨醇(Sphingosine)、1種鞘氨醇-1-磷酸(Sphingosine-1-phosphate)及1種糖化鞘氨醇(HexSphingosine)。

1.3 倫理學審查 本研究獲得首都醫科大學附屬北京佑安醫院醫學倫理審查委員會批準(批號：京佑科倫字[2017]14號)。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較 納入此項分析的97例患者中，男71例，女26例，平均(54.44±11.48)歲。66例病毒性肝炎肝硬化患者中，乙型肝炎肝硬化49例，丙型肝炎肝硬化15例，HBV重疊HCV所致肝硬化患者2例；31例非病毒性肝硬化患者中，酒精性肝硬化患者17例，原發性膽汁性肝硬化8例，藥物性肝硬化6例。

病毒性肝炎肝硬化患者與非病毒性肝硬化患者的年齡、男性比例、TBil、DBil及GGT等臨床指標之間差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的臨床特征比較

2.2 兩組患者外周血清鞘脂表達水平 57種鞘脂中，3種鞘脂表達水平差異均有統計學意義(P值均<0.05)，分別為Cer(d18∶1/12∶0)、HexCer(d18∶1/14∶1)和dhCer(d18∶0/2∶1)-1-P；其余鞘脂表達水平在兩組中差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表2)。

表2 兩組患者的外周血清鞘脂表達水平比較

2.3 logistic多因素回歸分析 將兩組表達水平有統計學差異的結果納入logistic多因素回歸分析，結果表明，dhCer(d18∶0/24∶1)-1-P水平高表達與病毒性肝炎肝硬化獨立相關(比值比=1.11, 95%可信區間：1.004～1.225,P=0.042)。

2.4 57種鞘脂在病毒性肝炎肝硬化中的亞組分析 對66例病毒性肝炎肝硬化患者進一步進行亞組分析，結果表明，Cer(d18∶1/12∶0)、HexCer (d18∶1/14∶1)和dhCer(d18∶0/24∶1)-1-P在乙型肝炎肝硬化和丙型肝炎肝硬化患者之間的表達水平差異均無統計學意義[Cer(d18∶1/12∶0)：(168.85±0.67) pmol/0.1 ml vs (168.88±0.69) pmol/0.1 ml,Z=-0.563,P=0.574；HexCer (d18∶1/14∶1)：(217.42±10.71) pmol/0.1 ml vs (213.65±3.20) pmol/0.1 ml,Z=-0.610,P=0.542；dhCer(d18∶0/24∶1)-1-P：(60.71±2.28) pmol/0.1 ml vs (60.67±2.07) pmol/0.1 ml,Z=-0.579,P=0.563]。其余54種鞘脂表達中，Cer(d18∶1/18∶0)、dhCer(d18∶0/18∶0)、dhCer (d18∶0/18∶1)和dhCer(d18∶0/16∶1)-1-P在乙型肝炎肝硬化和丙型肝炎肝硬化患者之間的表達水平差異均有統計學意義[140.69(77.19～215.90) pmol/0.1 ml vs 81.03(47.88～155.51) pmol/0.1 ml，Z=-2.084，P=0.037；60.62(59.89～61.44) pmol/0.1 ml vs 59.64(59.44～60.71) pmol/0.1 ml ，Z=-2.354，P=0.019；62.43(60.31～67.22) pmol/0.1 ml vs 60.77(59.84～62.12) pmol/0.1 ml ，Z=-2.171，P=0.030；131.06(107.76～184.42) pmol/0.1 ml vs 110.48(90.19～117.59) pmol/0.1 ml，Z=-2.829，P=0.005]。

3 討論

在亞太地區，病毒性肝炎是導致肝硬化、肝癌最重要的原因。雖然有部分研究報道了三類人群具有獨特的鞘脂代謝產物表達譜，可以作為輔助診斷的分子標志物[6-7]，但是病毒性肝炎肝硬化患者與非病毒性肝硬化患者的鞘脂代謝產物表達譜有何不同，目前尚未有研究報道，加強該方面研究有助于從鞘脂代謝角度闡明其發病機制、尋找新的治療靶標。本研究采用高效液相色譜-質譜分析方法，檢測病毒性肝炎肝硬化患者血清中57種鞘脂表達水平，首次發現dhCer(d18∶0/24∶1)-1-P與病毒性肝炎肝硬化密切相關。

雖然臨床實踐中用同樣的實驗室及生化檢查評估肝臟的損傷程度，但是病毒性肝炎肝硬化患者有自己獨特的臨床及病理特征。有研究[8]表明，與酒精性肝硬化患者容易發生凝血功能障礙和心肌病相比，病毒性肝炎肝硬化患者更易發生肝性腦病和心血管。同時有研究[9-11]表明，HBV或HCV感染者中，固有免疫細胞Toll樣受體可能參與機體抗病毒的過程，其表達下調，并伴隨病毒發生免疫逃逸。

二氫神經酰胺及糖化神經酰胺是神經酰胺從頭合成的中間產物，廣泛參與機體凋亡、誘導自噬及引起細胞周期阻滯等。本團隊[12-13]既往研究結果提示，二氫神經酰胺可能參與了肝臟疾病慢性化的過程，高表達的二氫神經酰胺(d18∶0/24∶0)可能與HBV相關慢加急性肝衰竭相關，而高表達的糖化神經酰胺可能與病毒復制相關，并且可能成為潛在的診斷生物學標志物。本研究結果與既往結果類似，檢測結果中大部分鞘脂表達水平在病毒性肝炎肝硬化中高于非病毒性肝硬化患者。磷酸化的二氫神經酰胺(PDHC)衍生于二氫神經酰胺，廣泛存在于血液循環、神經系統及臟器組織中，可能與機體固有免疫應答相關[14]。Nichols等[15-17]研究表明，PDHC能夠增強自身免疫應答，增加樹突狀細胞IL-6的釋放，并且與脂多糖表達無關，進一步推測PDHC可能通過作用于Toll樣受體2的配體而發揮作用。本研究的結果可能與此類似，dhCer(d18∶0/24∶1)-1-P高表達與病毒性肝炎肝硬化密切相關，但在HBV、HCV等不同病因肝炎肝硬化亞組分析中差異無統計學意義，表明其參與了病毒性肝炎的共同發病過程，可能病毒感染后誘發了機體固有免疫反應，但其具體的調節機制尚有待于進一步的研究。

綜上所述，本研究發現血清dhCer(d18∶0/24∶1)-1-P水平上調與病毒性肝硬化密切相關，可能有助于從鞘脂角度深入理解病毒性肝硬化的疾病特征。