冬凌草甲素促進人腦膠質瘤U251細胞放療敏感性的研究

李長宇，宋少軍，黃桂芳，祝 福，曹亞雷，金茂林，冉浩男

腦膠質瘤進展速度較快，可侵犯正常腦組織，浸潤性生長導致顱內壓逐漸升高，引起患者四肢乏力、惡心、頭暈、癲癇發作等癥狀[1-2]。如何減輕腦膠質瘤引起的顱腦損傷癥狀、恢復神經細胞功能已經引起越來越多學者關注。冬凌草甲素是冬凌草的活性成分，具有減小腦梗死體積、抗氧化、抗炎、擴張血管、抗疲勞、抑制血小板聚集等藥理作用[3-4]。本研究以人腦膠質瘤U251細胞株為模型，探討了冬凌草甲素對U251細胞放射治療(放療)敏感性的影響，以期為腦膠質瘤治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料 冬凌草甲素(Sigma公司，DMSO溶解后配置成相應濃度備用)，人腦膠質瘤U251細胞株(美國ATCC公司)，DMEM培養基(北京索萊寶科技有限公司)，噻唑藍(MTT)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，V-FITC和PI染色試劑盒(美國BD公司)，ECL化學發光液(北京Solarbio公司)，Hoechst 33258熒光染色試劑盒、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9抗體(上海碧云天公司)。

1.2方法

1.2.1人腦膠質瘤U251細胞培養：將人腦膠質瘤U251細胞培養于DMEM培養基(含有10%胎牛血清，鏈霉素100 mg/L，青霉素1×105U/L)中，置于37℃、5%CO2的培養箱，3 d換液一次，選取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2細胞分組：對照組為細胞常規培養，無其他干預。冬凌草甲素組在培養基中加入溶于DMSO的冬凌草甲素(10 μmol/L)，培養24 h。X線照射組：使用21EX型雙光子高能直線加速器，劑量率為4 Gy/min，總劑量為6 Gy，照射結束后繼續培養24 h。聯合放療(X線照射+冬凌草甲素)組：冬凌草甲素干預24 h后，給予X線照射。

1.2.3人腦膠質瘤U251細胞增殖抑制率：先配置MTT溶液(用PBS配置，將pH酸堿度調制7.4，配置MTT液濃度為5 mg/ml)，上述各組U251細胞培養于96孔板內，細胞密度為1×105/ml，棄去原有培養液，加入配置好的MTT液培養4 h，吸棄孔內上清液，每孔加150 μl DMSO液，搖床振蕩5 min，在酶聯免疫檢測儀上用570 nm吸光度進行檢測。

1.2.4人腦膠質瘤U251細胞凋亡熒光染色：采用Hoechst 33258熒光染色，人腦膠質瘤U251細胞經相應處理后用PBS液洗滌細胞2次，在150 μl 的Binding Buffer中加入2 μl Hoechst染液(10 μg/ml)避光反應15 min，棄去上清液，PBS液洗3遍，熒光顯微鏡下觀察結果并拍照。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡：收集各組細胞懸液，調整細胞密度1×106/ml，磷酸鹽緩沖液沖洗細胞后，分別加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，輕柔振蕩混勻，4 ℃避光反應30 min，流式細胞儀分析細胞凋亡水平。

1.2.6Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9的蛋白表達水平：采用Western Blot檢測，提取蛋白質后，以Brandford法測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。每孔加入40 μg蛋白樣品，然后行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓200 V，電泳40 min后轉膜，5%脫脂奶粉溶液4℃封閉2 h，加一抗(稀釋濃度1∶1000)過夜，洗膜后室溫下孵育二抗(稀釋濃度1∶2000)1 h，ECL化學發光法自顯影并采集圖像，利用樣本目的蛋白光密度對比內參條帶光密度，比較不同樣本的相對表達率。

2 結果

2.1冬凌草甲素對放療后人腦膠質瘤U251細胞增殖的影響 4組細胞的增殖率分別為：對照組(101.38±4.07)%、冬凌草甲素組(65.47±5.97)%、X線照射組(68.79±3.05)%、聯合放療組(44.43±5.27)%。與對照組相比，冬凌草甲素組、X線照射組、聯合放療組細胞增殖率降低，且聯合放療組低于冬凌草甲素組和X線照射組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2人腦膠質瘤U251細胞凋亡形態學比較 正常細胞的細胞核在熒光顯微鏡下表現為彌散淺藍色弱熒光；凋亡的細胞核表現為致密的亮藍色強熒光。4組細胞凋亡率分別為：對照組(4.66±2.73)%、冬凌草甲素組(25.03±7.56)%、X線照射組(24.83±6.07)%，聯合放療組(44.43±5.27)%。與對照組相比，冬凌草甲素組、X線照射組、聯合放療組凋亡細胞率增高，且聯合放療組高于冬凌草甲素組和X線照射組，差異有統計學意義(P<0.05)見圖1。

圖1 4組人腦膠質瘤U251細胞凋亡情況(Hoechst×200)

2.3流式細胞計數人腦膠質瘤U251細胞凋亡率比較 4組細胞凋亡率分別為對照組(4.13±3.52)%、冬凌草甲素組(31.03±4.71)%、X線照射組(22.58±5.73)%，聯合放療組(43.61±5.10)%。與對照組相比，冬凌草甲素組、X線照射組、聯合放療組細胞凋亡率增高，且聯合放療組高于冬凌草甲素組和X射線照射組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 流式細胞計數檢測4組人腦膠質瘤U251細胞凋亡率比較

2.4冬凌草甲素對放療后人膠質瘤U251細胞Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表達的影響 與對照組比較，冬凌草甲素組及X線照射組、聯合放療組Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表達水平均升高，且聯合放療組高于冬凌草甲素組和X線照射組(P<0.05)。見表1和圖3。

表1 4組Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白相對表達水平比較

圖3 冬凌草甲素對U251細胞內Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9表達水平的影響

3 討論

腦膠質瘤患者臨床表現多樣，同樣大小的腦膠質瘤在不同患者身上表現的癥狀也不相同，可長期無任何癥狀或僅出現輕微癥狀。上述表現與腫瘤本身的占位效應、日益增高的顱內壓及腫瘤周圍區域的腫脹有關。腦膠質瘤在神經系統以外的轉移非常罕見，部分手術患者僅表現為局部復發，或者擴展到顱內的其他部位[5-6]。高級別的腦膠質瘤很難通過手術完全切除，因此，有效的放化療對提高該類患者的生活質量，延長患者生存期至關重要。

腦膠質瘤綜合治療包括手術、化療和放療。放療是通過各種不同能量射線給予腫瘤組織均勻準確的照射，以抑制和殺滅癌細胞[7]，可單獨使用，也可與手術、化療等配合。由于腫瘤組織中乏氧細胞的存在，對放射線的耐受比氧細胞至少高3倍，常規放療不能殺死乏氧細胞，限制了放療的效果，這也是腫瘤復發和轉移的根源[8-10]。

文獻報道，冬凌草甲素具有抑制腫瘤細胞生長的作用，針對不同的腫瘤細胞，其抑制途徑各不相同[11-12]。X線照射細胞后，會引起細胞內一系列改變，包括分子、代謝水平、骨架結構和功能等，以應對X線的損傷[13-14]。本實驗結果顯示，與對照組相比，冬凌草甲素組、X線照射組及聯合放療組人腦膠質瘤U251細胞增殖率降低，且聯合放療組低于冬凌草甲素組及X線照射組。與對照組比較，冬凌草甲素組、X線照射組及聯合放療組人腦膠質瘤U251細胞凋亡率增高，且聯合放療組高于冬凌草甲素組及X線照射組。說明單用冬凌草甲素或放療對人腦膠質瘤U251細胞的直接抑制作用有限，但二者聯合應用，能夠增加U251細胞放療敏感性，表現為細胞增殖率明顯下降及凋亡率增加。Caspase家族在介導細胞炎癥、應激和凋亡過程中發揮著重要作用[15-18]。本研究結果顯示，與對照組相比，冬凌草甲素組和X線照射組均能上調U251細胞內的Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表達，且聯合放療組高于冬凌草甲素組及X線照射組。說明Caspase-3及Caspase-9共同參與了冬凌草甲素促進U251細胞放療敏感性的調節過程。

綜上所述，利用藥物增加生物體的放療敏感性，對腦膠質瘤的臨床治療有重要意義；冬凌草甲素可顯著提高腦膠質瘤U251細胞的放療敏感性，在腦膠質瘤的治療方面具有重要價值。