海南紅樹林淡紫擬青霉胞外多糖抗HSV-1作用研究

王永霞，王嬌嬌，黃燕妮，林英姿

單純皰疹病毒 (herpes simplex virus, HSV)屬于皰疹病毒科a亞科，在人群中感染極為普遍，潛伏和復發感染者可達90%[1]，可通過皮膚、黏膜直接接觸感染機體，引起的皰疹性角膜炎致盲率較高，未經治療的病毒性腦炎病死率可達80%，存活者亦可因中樞神經系統損傷留有智力、語言、行動障礙等不同程度后遺癥[2-4]。課題組前期從海南紅樹林中分離獲得一株淡紫擬青霉，體外研究發現其分泌的胞外多糖具有一定的抗HSV-1作用，可抑制病毒吸附和生物合成[5]，但體內抗病毒效果未知。本研究擬腹腔注射HSV-1建立小鼠感染模型，觀察淡紫擬青霉胞外多糖體內抗病毒作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑、儀器

1.1.1實驗動物：7周齡SPF級健康昆明種雄性小鼠75只，體重18～22 g，購于長沙市天勤生物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(湘)2014-0011。

1.1.2實驗試劑：淡紫擬青霉胞外多糖由本實驗室制備；非洲綠猴腎細胞(vero cell line, Vero細胞)購于中科院干細胞庫(SCSP-520、CCL-81TM)。HSV-1病毒液由本實驗室保存。小鼠干擾素-γ(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA 試劑盒均購于深圳欣博盛生物科技有限公司；病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒升級版(離心柱型)購于北京百泰克生物技術有限公司，HSV-1陽性模板購于武漢百泰基因工程有限公司(注冊號：國械注準20173400732)。

1.1.3實驗儀器：生物安全柜(SG403A-HE)購于Baker公司，CO2培養箱[(MCO-18AC)松下電器有限公司]，超聲波細胞粉碎機(SCIENTZ-950E)和高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技有限公司)，AE2000倒置生物顯微鏡(上海光學儀器廠)，高速冷凍離心機(美國Beckman公司)，PCR儀(Biometra GmbH公司)，酶標分析儀[(DNM-9606),北京普朗新技術有限公司]，全自動凝膠成像分析儀[(JY04S-3E)，北京君意東方電泳設備有限公司)]。

1.2方法

1.2.1病毒滴定：HSV-1于Vero細胞中傳代2次后接種于已長成單層的Vero細胞中，觀察48～72 h內的細胞病變情況(cytopathic effect， CPE)，當CPE達“+++～++++”時收獲病毒，按Reed -Muench法滴定其半數組織感染量(50 % tissue culture infective dose, TCID50)為10-4，擬用100TCID50濃度病毒感染小鼠。

1.2.2小鼠HSV-1感染模型建立：7周齡昆明種小鼠隨機分為正常對照組，病毒對照組，低、中、高劑量組，每組15只。低、中、高劑量組和病毒對照組小鼠分別給予HSV-1 0.5 ml腹腔注射，正常對照組小鼠給予DMEM 0.5 ml腹腔注射。次日低、中、高劑量組小鼠分別經腹腔注射淡紫擬青霉胞外多糖6、8、10 g/(kg·d)；正常對照組和病毒對照組腹腔注射生理鹽水0.5 ml，連續注射7 d。每日觀察并記錄小鼠的進食情況、有無倦怠、豎毛、蜷縮及死亡等。淡紫擬青霉胞外多糖干預結束后第3天，各組小鼠眼球取血，分離血清置于-20℃備用。處死小鼠，無菌條件下取肝臟，部分置于10%多聚甲醛中固定，常規制作石蠟切片進行HE染色，鏡下觀察肝臟病理變化。

1.2.3腦組織勻漿致Vero細胞病變作用：取各組小鼠同一部位腦組織20 mg，預冷PBS沖洗后，再于各管中加PBS 0.3 ml，組織研磨器研磨成勻漿，超聲破碎儀破細胞，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，取該上清液100 μl與2 ml含5%胎牛血清的DMEM混勻后，接種于已長成單層的Vero細胞中，觀察7 d內細胞病變情況。

1.2.4腦組織病毒載量檢測：另取各組小鼠同一部位的腦組織20 mg，加預冷PBS液0.5 ml，組織研磨器研磨成勻漿，12 000 r/min離心15 min。沉淀用HSV-1核酸檢測試劑盒提取病毒基因組DNA。HSV-1UL36基因引物據根據參考文獻[6]，序列如下，UL36F：5'-TAC GTC CTC ACC GTC ATC AAC-3'，UL36R：5'-CGC CAA AAG GTG TAA ATG TG -3'；反應體系為：Taq PCR MasterMix 11.25 μl，病毒基因組DNA或陽性對照模板DNA 1 μl，上下游引物各0.5 μl，ddH2O 6.75 μl，反應條件為：94℃ 5 min，94℃ 60 s，53℃ 40 s，72℃ 40 s，72℃ 7 min，共30個循環。取PCR產物6 μl進行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀觀察結果。通過Gel-Pro Analyzer圖像分析軟件分析產物電泳條帶的光密度掃描值，將實驗組與陽性模板UL36條帶光密度掃描值的比值作為UL36基因相對含量。

1.2.5血清中IFN-γ、IL-12和TNF-α分泌情況：采用ELISA法，試劑盒用前平衡至室溫，檢測方法按試劑盒說明書進行，酶標儀于波長450 nm處測定OD值，繪制標準曲線，根據各樣品OD值計算其細胞因子含量。

2 結果

2.1生存情況 除正常對照組外，其余4組小鼠接種HSV-1后次日出現食欲減退、豎毛、倦怠、蜷縮等癥狀，3～4 d達高峰。各組間小鼠死亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。各組未死亡小鼠于1周后癥狀開始緩解，胞外多糖干預組小鼠2周內完全緩解，而病毒對照組小鼠癥狀緩解較為緩慢，延遲至第3周。

表1 5組小鼠死亡情況比較

2.2肝臟病理變化 正常對照組小鼠肝小葉結構完整，細胞形態正常，以中央靜脈為中心呈放射狀排列；病毒對照組小鼠部分肝細胞腫脹，匯管區見大量炎性細胞浸潤，肝實質內有少量炎性細胞；低劑量組亦見肝組織中有大量炎性細胞浸潤，少數肝細胞腫脹；中劑量組肝組織內炎性細胞浸潤明顯減少；高劑量組肝實質內僅有少量炎性細胞浸潤，肝小葉結構完整。見圖1。

圖1 5組小鼠肝臟結構病理改變(HE×200)低、中、高劑量組小鼠分別給予淡紫擬青霉胞外多糖6、8、10 g/(kg·d)

2.3腦組織勻漿上清液致Vero細胞病變比較 HSV-1接種次日，病毒對照組和低劑量組少數細胞脫落、融合；正常對照組和中、高劑量組細胞病變不明顯。接種第3天病毒對照組和低劑量組細胞脫落明顯增多，融合細胞亦增多；中劑量和高劑量組少量細胞開始脫落、融合，但所致細胞病變作用明顯弱于病毒對照組和低劑量組，正常對照組未發現細胞病變。各組細胞病變于接種4～5 d達高峰。見圖2。

圖2 5組小鼠腦組織勻漿上清液Vero細胞形態(×100)低、中、高劑量組小鼠分別給予淡紫擬青霉胞外多糖6、8、10 g/(kg·d)；Vero為非洲綠猴腎細胞

2.4腦組織HSV-1病毒載量比較 病毒對照組HSV-1病毒DNA相對含量為0.505±0.025，低、中、高劑量組分別為0.496±0.055、0.248±0.034、0.262±0.033。與病毒對照組相比，中、高劑量組HSV-1病毒DNA相對含量明顯減低(P<0.01)，但低劑量組與病毒對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 5組小鼠腦組織HSV-1病毒載量比較1. Marker；2.正常對照組；3.低劑量組；4.中劑量組；5.病毒對照組；6高劑量組；7.陽性模板；低、中、高劑量組分別給予淡紫擬青霉胞外多糖6、8、10 g/(kg·d);HSV-1為單純皰疹病毒-1

2.5血清IFN-γ、IL-12、TNF-α含量比較 與正常對照組比較，病毒對照組和低、中、高劑量組血清IFN-γ、IL-12、TNF-α水平顯著升高(P<0.01)。高劑量組IFN-γ高于病毒對照組和低、中劑量組(P<0.01)，但病毒對照組和低、中劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)。中、高劑量組IL-12顯著高于病毒對照組和低劑量組(P<0.01)，但病毒對照組和低劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)。與病毒對照組比較，低、中、高劑量組TNF-α水平顯著降低，且高劑量組和中劑量組均低于低劑量組(P<0.01)。見表2。

表2 5組小鼠血清IFN -γ、IL-12和TNF-α水平比較

3 討論

多糖類化合物作為重要的生物活性物質，廣泛參與了生物體內細胞識別和功能調控，作用涉及細胞生命的全部時間和空間，多糖已被證實參與了病原體感染，糖鏈決定著細胞識別、聚集和受體作用，寄生物或病毒表面的寡糖能與宿主細胞表面的受體作用，產生感染。研究發現，真菌多糖能活化巨噬細胞和T、B淋巴細胞，誘導IFN-γ、IL-12和TNF-α等細胞因子分泌，調節固有免疫和適應性免疫[7-9]。海洋生物由于獨特的生活環境導致其產生的生物活性物質有別于陸生生物。本研究結果顯示，腹腔接種HSV-1后次日大部分小鼠出現食欲減退、豎毛、倦怠、蜷縮等癥狀，3～4 d達高峰，淡紫擬青霉胞外多糖干預組小鼠癥狀緩解較病毒對照組提前，但各組間死亡率比較差異無統計學意義。本研究結果顯示，與正常對照組比較，病毒對照組部分肝細胞腫脹，匯管區大量炎性細胞浸潤，肝實質內少量炎性細胞浸潤；低劑量組亦見肝組織中有大量炎性細胞浸潤；中劑量組炎性細胞浸潤明顯減少；高劑量組肝實質內僅有少量炎性細胞浸潤，肝小葉病變不明顯。說明淡紫擬青霉胞外多糖可緩解HSV-1感染所致的肝臟病理改變且該作用呈劑量依賴性。

將各組小鼠腦組織勻漿上清液接種于Vero細胞，發現中劑量和高劑量組較病毒對照組和低劑量組致細胞病變作用明顯減輕，說明淡紫擬青霉胞外多糖可能抑制了HSV-1在腦組織中的復制。本研究檢測了各組小鼠同一部位腦組織的HSV-1病毒DNA相對含量，結果顯示中、高劑量組HSV-1相對含量顯著低于病毒對照組，低劑量組HSV-1病毒DNA相對含量與病毒對照組比較差異無統計學意義。提示中劑量和高劑量淡紫擬青霉胞外多糖對HSV-1病毒的抑制作用較好，而低劑量對HSV-1病毒無明顯抑制作用；說明淡紫擬青霉胞外多糖對HSV-1病毒的抑制作用呈現一定的劑量依賴性。

IFN-γ作為重要的Th1型細胞因子可刺激病毒感染細胞表達MHC-1類分子、激活巨噬細胞、NK細胞等免疫細胞，參與抗病毒免疫；另外IFN-γ還可干擾病毒復制、抑制B細胞的功能[10-11]。IL-12作為重要的免疫調節因子，可刺激IFN -γ分泌，誘導Th1型抗病毒免疫反應[12-13]。TNF-α在HSV-1感染中具有一定的抗病毒作用，同時也參與了繼發性免疫損傷[14-15]。本研究結果顯示，病毒對照組小鼠血清IFN-γ、IL-12和TNF-α水平均顯著高于正常對照組。高劑量組IFN-γ高于病毒對照組和低、中劑量組；中、高劑量組IL-12顯著高于病毒對照組和低劑量組。與病毒對照組比較，低、中、高劑量組TNF-α水平顯著降低，且高劑量組低于中、低劑量組，中劑量組低于低劑量組。說明不同劑量淡紫擬青霉胞外多糖均不能對TNF-α分泌完全抑制，TNF-α的持續增高提示預后不良。

綜上所述，紅樹林淡紫擬青霉胞外多糖可能通過刺激IFN-γ和IL-12、抑制TNF-α分泌達到抗病毒的目的，也可能通過早期干預病毒復制，減少病毒載量，間接影響了細胞因子分泌，從而減輕了HSV-1感染后的免疫病理損傷。然而淡紫擬青霉胞外多糖的作用機制如何，作用靶點在哪，仍需進一步研究。