高效液相色譜-二極管陣列檢測法測定茵陳蒿散中的梔子苷

林仙軍，王 彬，陳曉林

(浙江省動物疫病預防控制中心，浙江 杭州 311101)

茵陳蒿散由茵陳、梔子和大黃通過粉碎、過篩、混合制得，處方的量分別是茵陳120 g、梔子60 g和大黃45 g。該散劑為淺棕黃色的粉末，氣微香，味微苦。具有清熱利尿[1]、解毒退黃[2]、清肝利膽[3]的作用，臨床主要用于治療濕熱黃疸[4-5]。該品種質量標準收載于《中國獸藥典》2015年版二部[6]，采用顯微法對茵陳、梔子和大黃進行鑒別。采用薄層色譜法分別鑒別大黃和梔子[7]，用到乙酸乙酯、甲醇、三氯甲烷、丙酮、甲酸乙酯等溶劑，環境污染嚴重，操作繁瑣。梔子是茵陳蒿散的臣藥，梔子苷是梔子的主要有效成分之一，具有瀉火除濕、清熱利尿[8]、涼血解毒[9]、保肝利膽[10]、抗氧化[11]、抗炎鎮痛、降血壓等作用[12]。采用標準未對梔子苷進行定量檢測，不能全面評價藥物，質量控制方法不完善。

高效液相色譜法快捷、準確、靈敏度高，定性和定量均準確。尤以高效液相色譜-二極管陣列檢測法(HPLC-DAD)結合了光譜掃描和數據庫功能，定性更準確，在獸藥檢驗中將發揮越來越大的作用。本試驗采用HPLC-DAD法對茵陳蒿散中的梔子苷檢測的方法進行了研究，為茵陳蒿散質量控制提供數據。

1 儀器與材料

1.1儀器 高效液相色譜儀，Agilent 1260，配Agilent 1260 Infinity G4212A型DAD檢測器；XS205電子天平(Mettler公司)；DELTA320 pH計(Mettler公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試劑與材料 乙腈為色譜純，甲醇、磷酸、鹽酸、氫氧化鈉、30%雙氧水均為分析純;實驗用水為milli-Q超純水。梔子苷對照品，來源中國食品藥品檢定研究院，批號110749-201115，含量99.7%。茵陳蒿散，來源浙江博信藥業股份有限公司，批號為20181001、20181002和20181003；來源杭州愛力邁動物藥業有限公司，批號為T191001、T191002和T191003。

2 方法與結果

2.1對照品溶液的配制 取梔子苷對照品7.00 mg，置50 mL量瓶中，加水適量，超聲處理使溶解并稀釋至刻度，搖勻制成對照品儲備液。

2.2供試品溶液的配制 精密稱取供試品約0.5 g于100 mL量瓶中，水適量，超聲處理20 min，用水稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.3色譜條件 采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：0.05%磷酸溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序見表1；進樣量10 μL，柱溫30 ℃，流速為1.0 mL/min，用二極管陣列檢測器進行掃描，掃描范圍為200～400 nm，記錄240 nm波長處的色譜圖。該色譜條件下梔子苷色譜峰良好。對照品溶液色譜圖見圖1，對照品溶液光譜圖見圖2；供試品溶液(T191101)色譜圖見圖3，供試品溶液(T191101)中梔子苷光譜圖見圖4。

圖1 梔子苷對照品溶液色譜圖

圖2 梔子苷對照品溶液光譜圖

圖3 茵陳蒿散(T191101)色譜圖

圖4 茵陳蒿散(T191101)中梔子苷光譜圖

表1 流動相梯度洗脫程序表

2.4方法學考察

2.4.1線性范圍考察 精密量取對照品儲備液適量，用水稀釋2倍、5倍、10倍、20倍和50倍。制成相應濃度的系列標準品溶液，從低濃度到高濃度依次進樣分析，以濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得線性方程和相關系數，2.790～139.6 μg/mL，Y=11.55526X-10.36225，相關系數為0.99989。

2.4.2精密度試驗 取批號為T191101茵陳蒿散供試品溶液，按上述色譜條件重復連續進樣6次，測得梔子苷峰面積相對標準偏差為1.2%。表明此方法的儀器精密度符合要求。

2.4.3穩定性試驗 取批號為T191101茵陳蒿散供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、12 h和24 h進行測定，測得梔子苷峰面積相對標準偏差為0.7%。表明供試品溶液穩定性良好。

2.4.4方法專屬性 取T191101茵陳蒿散各0.5 g，置10 mL量瓶中，分別加1 mol/L鹽酸溶液、1 mol/L氫氧化鈉溶液和5%過氧化氫溶液各1 mL，放置1 h，用50%甲醇溶液定容，依法測定。梔子苷在鹽酸溶液和過氧化氫溶液均穩定，峰面積減少在3%以內；在氫氧化鈉溶液中，峰面積減少約50%。

2.4.5加樣回收率試驗 取梔子苷適量，加甲醇1 mg，配制成約每毫升的加樣回收率試驗溶液。另取批號為T191101的茵陳蒿散樣品6份，各0.25 g，分別精密加入加樣回收率試驗溶液各2.5 mL，置100 mL量瓶中，按照2.2項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下條件檢測，結果扣除茵陳蒿散樣品原有梔子苷的量，計算平均回收率為98.9%，RSD為1.2%。

2.4.6實際樣品的測定 取批號為T191101、T191102、T191103、20181001、20181002和20181003的茵陳蒿散3個平行，各0.5 g，按照2.2項下方法配制供試品溶液，依法檢測，記錄色譜圖，按外標法計算梔子苷含量，結果見表2。

表2 樣品中含量測定結果(n=3)

3 討論

3.1提取溶劑的選擇 梔子苷易溶于水，溶于乙醇、甲醇，不溶于石油醚。本試驗選擇了水、甲醇、50%甲醇、50%乙醇和50%乙腈超聲20 min超聲提取，結果見圖5，圖中序號1、2、3、4、5分別對應以上5種提取溶劑，梔子苷在50%甲醇、水、50%乙醇和50%乙腈中提取效率均較好，在純甲醇中提取效率較差。50%乙腈提取后，峰型較差。50%乙醇和50%甲醇提取雜質稍微多一些。因此，綜合考慮，選擇水作為茵陳蒿散供試品的提取溶劑。在這基礎上，進行超聲時間的確認，試驗分別超聲5 min、10 min、15 min和20 min，結果檢測出梔子苷的含量分別是12.25 mg/g、12.28 mg/g、12.35 mg/g和12.37 mg/g，表明梔子苷在水中超聲非常容易溶解，5 min以后無顯著差異。因此，為了確保提取充分，選擇超聲時間為10 min。

圖5 提取溶劑對含量的影響

3.2檢測波長的選擇 本試驗采用二極管陳列檢測器對梔子苷進行全波長掃描，結果發現，梔子苷在240 nm波長有最大吸收，綜合考慮，梔子苷的響應及雜質干擾因素，選擇240 nm作為檢測波長。

3.3流動相的選擇 考察了乙腈與0.01%磷酸溶液、0.05%磷酸溶液、0.2%磷酸溶液和0.4%磷酸溶液作為流動相，各流動相保留時間和峰形一致，而乙腈-0.4%磷酸溶液pH值為1.5，乙腈-0.2%磷酸溶液pH值為1.7，pH值小于2.0對色譜柱損害較大；而乙腈-0.05%磷酸溶液pH值為2.3左右。因此，選擇0.05%磷酸溶液-乙腈作為流動相，調節流動相比例，梔子苷和其他組分分離度達到1.5，保留時間比較合適，確定梯度洗脫程序。

3.4定性定量 供試品溶液色譜圖中如出現和梔子苷對照品溶液色譜圖中保留時間一致的色譜峰，保留時間差異不大于±5%，且為單一物質峰；在200～400 nm波長范圍內，兩者紫外光譜圖匹配，且最大吸收波長一致，差異不大于±2 nm，則判定為檢出梔子苷。

3.5小結 本文采用HPLC-DAD法對茵陳蒿散中梔子苷進行檢測，對提取溶劑、提取方式、檢測波長、專屬性和色譜條件等進行研究，方法定性定量準確，適用于茵陳蒿散中梔子苷的含量檢測。