基于αCaMKⅡ-CREB-BDNF 信號通路研究調心方對APP／PS1 雙轉基因AD 小鼠學習記憶和突觸可塑性的影響

王曉雯 ，錢 紅 ，沈春娟 ，李燕軍 ，袁海新 *，王 健

1 上海市第五康復醫院，上海 201699；2 上海中醫藥大學康復醫學院，上海201203

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種不可逆轉的中樞神經系統退行性疾病。 目前，全世界范圍內有超過5 000 萬AD 患者，到2050 年，預計將有 15 000 萬 AD 患者［1］。 AD 的主要發病人群為60 歲以上的老年人，其患病率隨人口老齡化日益增加。在我國60 歲以上人群的患病率為0.53%～5.67%，85 歲以上為 20%～50%［2］。 AD 的臨床特征是隱匿起病，早期主要出現近期記憶力減退，隨著病情的發展，視空間、計算力、語言、運動神經系統功能均可出現障礙，在后期甚至出現妄想、錯覺、焦慮、抑郁等精神癥狀，不僅對老年人的日常生活能力造成了嚴重的影響，也給照料者和社會帶來了沉重的負擔［3］。 目前有許多研究進行 AD 治療藥物研發，據不完全統計正在研發／已研發的藥物有200 多種，但其中99%藥物因中期結果無效或副作用不能耐受等原因導致失敗［4］，僅有極少數藥物被批準用于治療AD，而這些藥物只能控制癥狀，并無法改變疾病的進程。 如多奈哌齊就是臨床上治療輕中度AD 的常用藥物［5］，它是一種可逆性的乙酰膽堿酶抑制劑，能有效改善認知功能。

近年來，隨著中醫學對AD 防治的深入研究，發現中醫藥在AD 的防治方面有著明顯的優勢。 林水淼教授［6］結合多年臨床經驗提出輕中度AD 患者以心氣虛證為主，治療宜從心入手，研究發現調心方能有效改善氧化損傷型類AD 大鼠空間記憶能力和神經元鈣穩態［7］。本課題組前期研究發現，經過調心方治療后，APP／PS1 雙轉基因小鼠的學習獲取能力和空間記憶保持能力均明顯提高［8］。 但有關于其具體的作用機制還未明確。 APP／PS1 雙轉基因小鼠能夠模仿AD 的病理變化，常被用于AD 和神經退行性病變的神經生物學研究［9］。 αCaMKⅡ-CREBBDNF 信號通路是形成及維持空間學習記憶能力和長時程增強（long-term potentiation，LTP）的重要信號通路之一［10］。 本研究基于 αCaMKⅡ-CREB-BDNF 信號通路探討調心方改善AD 學習記憶和突觸可塑性的具體作用機制，選擇采用3 月齡APP／PS1雙轉基因小鼠為AD 病理模型，通過電生理技術誘導小鼠海馬CA1 區LTP，實時熒光定量聚合酶鏈反應 （real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）法檢測小鼠海馬區α 鈣／鈣調素依賴激Ⅱ（alpha calcium ／calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，αCaMKⅡ）、環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（cyclic AMP response element binding protein，CREB）、腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、突觸后致密物 95（postsynaptic density protein-95，PSD-95）mRNA 表達；采用 Western blot 法檢測 p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF、PSD-95 蛋白表達。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

選取 SPF 級 3 月齡 APP／PS1 雙轉基因雄性小鼠 54 只，體質量（25.22±1.71）g，按照隨機數字表法將APP／PS1 雄性小鼠分為模型組、多奈哌齊組、調心方組。另設同月齡同品系同月齡C57／BL6 雄性野生型小鼠 18 只為正常組，體質量（30.49±1.59）g。以上實驗動物均由南京大學模式動物研究所提供，品系編號為 D00268，許可證號：SCXK（蘇）2015-0001。 動物實驗在上海中醫藥大學動物實驗中心進行，實驗過程中動物飼養和操作嚴格遵循實驗動物倫理學準則。

1.2 主要儀器與試劑

超薄切片機（德國Leica 公司）；全波長酶標儀、梯度PCR 儀（美國Thermo 公司）；伯樂電泳儀、伯樂寬式水平電泳槽、轉印電泳槽（美國BIO RAD 公司）；水浴鍋、隔水式恒溫培養箱（上海精密實驗設備公司）；化學發光成像儀（上海天能公司）。 Trizol、隨機引物（美國 Invitrogen 公司）；RIPA、PMSF、BCA試劑盒、PBS、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、5Xloadingbuffer、SDS-PAGE 電泳液、Western 轉膜液（上海碧云天生物技術公司）；BDNF 抗體、p-CREB（S133）抗體、p-αCaMKⅡ（T286）抗體、GAPDH 抗體、PSD95抗體（英國 Abcam 公司）；αCaMKⅡ-α、CREB、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H＋L）（美國CST 公司）。

1.3 主要藥物

調心方顆粒（江蘇江陰天江藥業有限公司），其成分主要包括黨參、石菖蒲、桂枝、甘草、白芍、龍骨、遠志等；鹽酸多奈哌齊（江蘇豪森藥業股份有限公司，生產批號：H20030472）。

2 實驗方法

2.1 干預方法

參照藥理試驗中動物與人體間的等效劑量換算標準進行折算，多奈哌齊組和調心方組均按照人的等效劑量（體質量：60 kg）折算出藥物劑量。 正常組和模型組給予等量生理鹽水 10 mL／（kg·d）；多奈哌齊組給予鹽酸多奈哌齊灌胃，劑量為 0.05 mg／（kg·d）；調心方組給予調心方顆粒灌胃，劑量為0.057 g／（kg·d）［11］；4 組小鼠于 3 月齡時進行灌胃給藥處理，1 次 ／d，連續灌胃 3 個月。

2.2 取材

2.2.1 腦片制備 4 組各隨機選取5 只小鼠，于小鼠腹腔注射20%的水合氯醛，待小鼠麻醉后，快速斷頭，取出腦組織移至95%O2＋5%CO2混合氣飽和的人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF）中，ACSF 溶液溫度為 0 ℃，放置 1 min。 去除前腦和小腦，用膠水將剩余腦組織塊粘在切片臺上。 用振動切片機冠狀切取海馬腦片，海馬腦片大小為400 μm，放入34 ℃的孵育槽中孵育0.5 h，然后放在（25±1） ℃持續通入 95%O2＋5%CO2混合氣飽和的 ACSF溶液中2～8 h。

2.2.2 腦組織樣本制備 4 組各隨機選取7 只小鼠，將小鼠腹腔注射20%的水合氯醛，待小鼠麻醉后，快速斷頭，取出腦組織移置-20 ℃的冰盒上，迅速剝離左右兩側海馬置于EP 管中，儲存于-80 ℃冰箱內，以待RT-qPCR 和Western blot 檢測備用。

2.3 指標檢測

2.3.1 離體海馬CA1 區LTP 誘導 待腦片孵育結束后，在顯微鏡下將腦片移進記錄槽中，使用32～34 ℃的 95%O2＋5%CO2混合氣飽和的 ACSF 溶液持續灌流，速度為3 mL／min，在海馬CA1 區記錄興奮性突觸后電位。 具體步驟如下：①確定海馬CA1區：顯微鏡下確定海馬的CA1 區。②準備刺激電極、記錄電極：選擇1 個單級鎢絲的微電極刺激作為刺激電極，尖端直徑1～2 μm，尖端暴露長度為15～40 μm；記錄電極為玻璃管記錄電極，ACSF 溶液充滿玻璃管，電阻1～5 MΩ，將其放在CA1 區的同一層。③ 刺激海馬CA1 區：將刺激電極放在海馬CA1區 stratum radium 層，刺激 Shaffer collateral 纖維，以0.033 Hz 頻率，100 μs 波寬，每隔 30 s 給 1 個刺激，刺激強度為0.1～0.7 mA。 ④ 記錄場興奮性突觸后電位：每給1 個刺激記錄1 個場興奮性突觸后電位（field excitatory postsynaptic potential，fEPSP），以 30%fEPSP 最大刺激強度為基線，記錄30 min；在前30 min 基礎 fEPSP 曲線保持穩定后，LTP 應用100 Hz 高頻刺激（high frequency stimulation，HFS）誘導1 s，LTP 誘發成功后持續記錄 60 min，選擇其中的第50～60 min 的fEPSP 平均斜率觀察LTP 水平。LTP 是在強直剌激下誘發的突觸傳遞功能長時間增強現象，反映了突觸傳遞效能的持久變化［12］。⑤繪制刺激強度-反應曲線：以刺激強度為橫坐標，fEPSP斜率為縱坐標，繪制刺激強度-反應曲線（input-output curve，I／O），I／O 曲線能夠反映神經環路的基本突觸傳遞特性。 ⑥觀察短時程突觸可塑性：在海馬Schaffer 側枝CA1 區的突觸通路上，從20～250 ms 雙脈沖刺激間隔的雙脈沖易化（paired pulse facilitation，PPF）即短時程的突觸可塑性。 在 30%fEPSP 最大刺激強度的刺激下，一般會產生前后2 個突觸后興奮電位，后1 個fEPSP 斜率／前1 個fEPSP斜率就是PPF 值。 它可通過觀察突觸后的反應來推測突觸前神經遞質的釋放情況。 以上數據采用Clampfit 軟件進行分析。

2.3.2 海馬 CA1 區 αCaMKⅡ、CREB、BDNF 和 PSD-95mRNA 含量檢測 采用RT-qPCR 法檢測海馬αCaMKⅡ、CREB、BDNF 和 PSD-95mRNA 的含量。4 組小鼠各隨機選取4 個海馬組織，采用Trizol 法提取總 RNA， 使用酶標儀檢測總RNA 的濃度和純度，光密度（optical density，OD）比值可以判斷RNA純度，OD260／OD280在 1.8～2.0 之間，表示 RNA 純度較好。 RNA 純度測定后，利用 cDNA 合成試劑盒將2 μg RNA 逆轉錄為 cDNA。PCR 擴增條件：95 ℃預變性 2 min，需執行 1 個循環。 先 95 ℃變性 5 s，后60 ℃退火10 s，需執行45 個循環。循環結束后緩慢升溫，生成各基因的熔解曲線。 采用GAPDH 作為內參基因，利用熒光定量 PCR 儀對目的基因αCaMKⅡ、BDNF、CREB、PSD-95 進行定量檢測。 使用 PCR系統軟件，觀察熔解和擴增曲線，記錄各組目的基因的 Ct 值，相對定量采用 2-△△Ct法。 引物由 NCBI Primer-blast 設計，序列參照Gene Bank 數據庫中的基因序列，由蘇州金唯智公司合成。 序列為：①BDNF：上游 5’-GGTATCCAAAGGCCAACTGA-3’；下游 5’-CTTATGAATCGCCAGCCAAT-3’。 ② CREB：上游 5’-CAGACAACCAGCAGAGTGGA-3’，下游5’-GGGCTAATGTGGCAATCTGT-3’。 ③ GADPH：上游 5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’。 ④ PSD-95：上游 5’-CTATGAGACGGTGACGCAGA-3’，下游5’-CGGGAGGAGACAAAGTGGTA-3’。⑤αCaMKⅡ：上游 5’-CAGCCACTGTATCCAGCAGA-3’，下游5’-GAGGCCAGCAACAGATTCTC-3’。

2.3.3 海馬 CA1 區 p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF和PSD-95 蛋白含量檢測 采用Western blot 法檢測海馬 p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF 和 PSD-95 的蛋白含量。 4 組隨機選取3 個在-80 ℃冰箱中儲存的海馬組織，按蛋白提取試劑盒上操作要求提取蛋白，使用BCA 法測定各組蛋白濃度。 繪制標準曲線，計算出4 組樣本的蛋白濃度，使用RIPA 裂解液將各組蛋白定容至等體積，濃度為1 μg／μL，在100 ℃水浴鍋中煮沸10 min，置于-20 ℃冰箱中備用。 經過SDS-PAGE 凝膠配制、凝膠電泳、轉膜、蛋白印跡后，進行圖像分析。 所有條帶均采用Al-Phaview SA 軟件進行處理分析。

2.4 統計學分析

采用SPSS 21.0 統計軟件進行數據分析。 計量資料用（）表示，數據符合正態分布且方差齊時，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗；方差不齊用Wilcoxon 秩和檢驗。 重復測量數據用重復測量方差分析。 P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 4 組小鼠海馬 CA1 區 LTP 比較

見圖1。

圖 1 4 組海馬 CA1 區 LTP 圖Figure 1 LTP figure of hippocampal CA1 in four groups

3.2 4 組小鼠海馬區 αCaMKⅡ、CREB、BDNF 和PSD-95 mRNA 表達比較

見表 1、圖 2。

表 1 4 組海馬 αCaMKⅡ、CREB、BDNF、PSD-95 mRNA 表達比較（）Table 1 Comparison of αCaMKⅡ, CREB, BDNF, PSD-95 mRNA expression in the hippocampus in four groups （）

表 1 4 組海馬 αCaMKⅡ、CREB、BDNF、PSD-95 mRNA 表達比較（）Table 1 Comparison of αCaMKⅡ, CREB, BDNF, PSD-95 mRNA expression in the hippocampus in four groups （）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。Note: Compared with the normal group, 1) P＜0.05; Compared with the model group, 2) P＜0.05.

PSD-95 1.00±0.34 0.62±0.051）1.00±0.072）0.94±0.112）組別正常組模型組多奈哌齊組調心方組n 4 4 4 4 αCaMKⅡ1.00±0.22 0.58±0.071）0.93±0.082）0.91±0.072）CREB 1.00±0.29 0.63±0.001）0.88±0.19 0.96±0.092）BDNF 1.00±0.20 0.51±0.111）0.91±0.272）0.94±0.032）

圖 2 4 組小鼠海馬區 αCaMKⅡ、CREB、BDNF 和 PSD-95 mRNA 表達比較Figure 2 Comparison of αCaMKⅡ，CREB，BDNF and PSD-95 mRNA expression in the hippocampus in four groups

3.3 4 組小鼠 海馬 區 p-αCaMK Ⅱ、p-CREB、BDNF和PSD-95 的蛋白表達比較

見表 2、圖 3、圖 4。

表 2 4 組海馬區 p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF 和 PSD-95 蛋白表達比較（）Table 2 Comparison of p-αCaMKⅡ, p-CREB, BDNF and PSD-95 protein expression in the hippocampus in four groups （）

表 2 4 組海馬區 p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF 和 PSD-95 蛋白表達比較（）Table 2 Comparison of p-αCaMKⅡ, p-CREB, BDNF and PSD-95 protein expression in the hippocampus in four groups （）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。Note: Compared with the normal group, 1) P＜0.05; Compared with the model group, 2) P＜0.05.

PSD-95 1.00±0.12 0.58±0.081）0.85±0.072）0.92±0.092）組別正常組模型組多奈哌齊組調心方組n 3 3 3 3 p-αCaMKII 1.00±0.20 0.47±0.061）0.46±0.06 0.86±0.142）p-CREB 1.00±0.10 0.66±0.081）0.90±0.032）0.95±0.112）BDNF 1.00±0.05 0.65±0.091）0.86±0.092）0.90±0.092）

4 討 論

中醫學將AD 歸于“呆病”“郁證”“癲證”等范疇，對于AD 不同階段的病機、治則、治法尚未達成共識。AD 主要臨床表現為認知功能障礙，有研究發現AD 的基本病機為：心氣虛衰，氣不生神，為本虛；痰滯瘀阻，蒙蔽神竅為標實。 根據“緩則治其本”“治病必求于本”的原則，從“心”入手，調心氣可以治療AD。 調心方中黨參功擅補心氣，安神增智為君；桂枝溫通血脈，振奮心陽為臣；石菖蒲安神益智，開竅為佐；遠志通竅豁痰，增智為使。 諸藥配伍具有益心氣化痰開竅之功效［13］。 有臨床研究顯示，調心方能夠改善輕、中、重度AD 患者的認知功能和日常生活能力，通過提高后扣帶回與腦功能區的連接，從而達到改善腦功能的作用［14］。 有基礎研究發現，調心方可以抑制神經細胞凋亡、乙酰膽堿的水解、膠質細胞激活、Tau 蛋白的過度磷酸化、Aβ 寡聚體的生成，減輕神經炎癥反應、抗氧化應激等多個靶點和途徑，從而達到改善AD 發生、發展的作用。 但有關于調心方是如何改善AD 患者學習記憶能力的具體作用機制還不夠明確，因此本研究嘗試基于αCaMKⅡ-CREB-BDNF 信號通路探討調心方對APP／PS1 雙轉基因AD 小鼠學習記憶和突觸可塑性的影響，以期為探討調心方改善AD 患者學習記憶能力的具體作用機制提供依據。

圖 3 4 組海馬區 p-αCaMKⅡ，p-CREB，BDNF 和PSD-95 的蛋白條帶顯影Figure 3 Protein band development on p-αCaMKⅡ, p-CREB, BDNF and PSD-95 protein expression of the hippocampus in four groups

4.1 調心方能夠改善APP／PS1 雙轉基因AD 小鼠海馬突觸可塑性

LTP、PPF、I／O 是突觸功能可塑性的 3 個重要電生理指標。本研究結果顯示，4 組分組效應和刺激強度效應均無明顯區別；分組和刺激時間因素無明顯的交互作用；在0.1～0.7 mA 刺激強度下，4 組小鼠海馬 I／O 曲線斜率無明顯區別；在 50、100、200、250 ms的不同刺激間隔下，4 組PPF 易化無明顯區別。 這說明APP／PS1 小鼠海馬LTP 的損傷與基本突觸傳遞和突觸前神經遞質釋放無關，APP／PS1 雙轉基因小鼠的基本突觸傳遞效能無發生障礙，這提示6 月齡的APP／PS1 小鼠海馬LTP 的損傷與基本突觸傳遞和突觸前神經遞質釋放無關。 第50～60 min 的海馬fEPSP 斜率組間比較結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠fEPSP 斜率明顯降低，提示模型組小鼠海馬LTP 受損。 與模型組比較，調心方組fEPSP 斜率均明顯提高。這說明調心方可改善APP／PS1雙轉基因AD 小鼠LTP 的抑制，改善其突觸傳遞效能，從而提高突觸可塑性，改善學習記憶能力。 這與ROLLAND 等［15］發現突觸可塑性與神經系統的發育、損傷、修復及學習記憶等密切相關的研究結果一致。

圖 4 4 組海馬區 p-αCaMKII，p-CREB，BDNF 和 PSD-95 的蛋白表達比較Figure 4 Comparison of p-αCaMKⅡ, p-CREB, BDNF and PSD-95 protein expression of the hippocampus in four groups

此外，本研究還發現，與正常組比較，6 月齡的APP／PS1 雙轉基因 AD 小鼠海馬 PSD-95 蛋白和mRNA 表達明顯降低；與模型組比較，調心方組小鼠海馬區的PSD-95 mRNA 和蛋白表達明顯提高。這說明APP／PS1 雙轉基因AD 小鼠腦內有突觸可塑性受損的現象，LTP 受到抑制；經過調心方治療后PSD-95 的蛋白活性和基因表達明顯提高，LTP 抑制得到改善，突觸可塑性提高，從而改善學習和記憶能力。 突觸后致密物在突觸可塑性中具有重要作用，PSD-95 蛋白通過與突觸后致密區多種蛋白分子的相互作用，起到了調節突觸可塑性的功能，它在LTP 的形成及維持過程、突觸可塑性、學習記憶等方面具有關鍵性的作用［16］。APP ／PS1 雙轉基因 AD小鼠海馬PSD-95 蛋白活性明顯降低，PSD-95 異常表達會導致LTP 受到抑制，進而誘發突觸可塑性發生改變，使AD 小鼠出現依賴海馬的學習記憶功能的缺陷，這與魏鵬［17］的研究結果一致。

4.2 調心方能夠調節APP／PS1 雙轉基因AD 小鼠海馬αCaMKⅡ-CREB-BDNF 信號通路水平

αCaMKⅡ通過Thr286 位點自身磷酸化成為活化狀態，它的激活是其突觸功能調節及學習記憶的結構基礎［18］，是 LTP 形成的重要介質，對實現信息的儲存具有重要作用。 Ca2+進入細胞內與CaM 結合形成Ca2+-CaM，能夠活化CaMKI，磷酸化后的αCaMKⅡ可以直接活化 CREB［19］。 CREB 是 LTP 產生的重要調節因子，CREB 缺失會導致LTP 出現明顯損傷［20］，它位于 133 位點的絲氨酸殘基（Ser133）的磷酸化對多種與學習記憶相關的基因轉錄起著重要作用。BDNF 是CREB 的經典下游靶基因，其基因啟動子區域含有CRE 序列，CREB 可與CRE 序列結合，引起 BDNF 的轉錄增加［21］，BDNF 是 LTP 和突觸傳遞重要的調節器之一，在突觸可塑性、長時記憶的形成等方面起到重要作用。

本研究結果顯示，與正常組比較，模型組海馬p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF 蛋白水平和 αCaMKⅡ、CREB 和BDNF mRNA 明顯降低，這與模型組PSD-95 表達、LTP 受到抑制的結果相互印證；與模型組比較，調心方組海馬 p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF蛋白水平和 αCaMKⅡ、CREB 和 BDNF mRNA 表達明顯提高。 這提示，調心方組能有效改善APP／PS1雙轉基因AD 小鼠海馬αCaMKⅡ-CREB-BDNF 信號通路水平。 調心方可能通過激活αCaMKⅡ，上調了αCaMKⅡ的磷酸化蛋白水平及αCaMKⅡmRNA表達，進而激活其下游的CREB，使得CREB 磷酸化水平及CREB mRNA 表達增加，促進其下游BDNF的基因轉錄和蛋白合成，提高 BDNF mRNA 和BDNF 蛋白表達；BDNF 表達增加可在αCaMKⅡ的翻譯過程中上調PSD-95 磷酸化水平，引起TrkB 對BDNF 的敏感性增加，從而激活 CREB-BDNF 信號通路，使突觸可塑性發生改變，提高LTP，從而改善突觸可塑性及學習記憶能力。 這與ESCOBAR 等［22-23］等研究結果一致。

5 小 結

調心方能夠改善APP／PS1 雙轉基因AD 小鼠海馬CA1 區 LTP、提高PSD-95 mRNA 和蛋白的表達，從而改善APP／PS1 雙轉基因AD 小鼠學習記憶功能和突觸可塑性，其作用機制可能與其上調海馬αCaMKⅡ-CREB-BDNF 信號通路水平有關。