骨折挫傷膠囊質量評價

孔令鋒，王鐵軍，郭漢文，李成森，孫苓苓，王歡

(1.遼寧省藥品檢驗檢測院，遼寧 沈陽 110036； 2.丹東市藥品檢驗檢測中心，遼寧 丹東 118000；3.山東泓潤健康科技有限公司，山東 濟南 250022)

骨折挫傷膠囊收載于《中國藥典》2015年版(一部)，該處方主要由豬骨(制)、黃瓜子(炒)、土鱉蟲、自然銅(煅)、乳香(制)、沒藥(制)、血竭、紅花、大黃、當歸組成。具有舒筋活絡，消腫散瘀，接骨止痛之功效。其療效確切，為跌打損傷首選藥物之一[1-3]，該品種為2016年國家評價性抽驗品種，全國共有生產企業13家，批準文號13個。

本次共抽取112批次樣品，涉及生產企業8家、批準文號8個，按國評工作方案，進行了法定標準檢驗。基于法定檢驗結果，以問題為導向，結合該品種處方含貴細藥、礦物藥、動物藥等特點，參考相關文獻[4-10]從藥品安全性、有效性、穩定性方面進行了探索性研究，綜合法定標準檢驗與探索性研究的結果，對骨折挫傷膠囊質量情況進行評價，為藥品監管及質量標準提升提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent Technologies 1260series高效液相色譜儀，包括G1311C四元梯度泵，G1329B自動進樣器，G4212B二極管陣列檢測器，Agilent Ezchromn色譜工作站；HU10260B型超聲波清洗器；Sartorius CP225D電子天平；普析通用TU-1950型紫外可見分光光度計；PerkinElmer PinAAcle 900T原子吸收光譜儀；CEM-MARS 微波消解儀。

1.2 試藥 血竭素高氯酸鹽對照品(批號：110811-201506，純度98.6%)、羥基紅花黃色素A對照品(批號：111637-201106，純度92.5%)、大黃酚對照品(批號：110796-201319，純度99.6%)、11-羰基-β-乙酰乳香酸對照品(批號：111760-201502，純度99.3%)均購自中國食品藥品檢定研究院；鉛元素標準溶液(批號：GSB 04-1742-2004)、鎘元素標準溶液(批號：GSB 04-1721-2004)、砷元素標準溶液(批號：GSB 04-1714-2004)、汞元素標準溶液(批號：GSB 04-1729-2004)、銅元素標準溶液(批號：GSB 04-1725-2004)均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心，乙醇、乙腈為色譜純，硝酸及鹽酸為優級純，水為重蒸水。骨折挫傷膠囊共112批次，均來自國家評價性抽樣樣品，共8家生產企業(A～H)。

2 法定標準檢驗

2.1 標準檢驗結果 骨折挫傷膠囊質量標準為《中國藥典》2015年版(一部)，檢驗項目包括性狀、顯微鑒別、大黃和紅花的薄層鑒別、常規檢查項和血竭素HPLC含量測定。對112批樣品按法定標準檢驗均符合規定，合格率100%。

2.2 標準評價 對骨折挫傷膠囊現行標準進行分析， 認為現行標準設置不夠全面，因血竭素高氯酸鹽穩定性差，現行標準限度值有待商榷，未對紅花、大黃、乳香等藥材進行控制，導致必要的檢驗項目缺失。該品種為生藥原粉制劑，可能存在染色、摻偽、重金屬超標等隱患，無法對產品的安全性、有效性進行控制。

3 探索性研究

從藥品安全性、有效性、穩定性等方面對65批樣品(去除重復批號后)進行探索性研究，達到全面評價該品種整體質量的目的。

3.1 藥品安全性研究

3.1.1 非法染色 骨折挫傷膠囊為全原粉制劑，處方中有紅花、血竭藥材，針對可能存在的摻偽染色問題，采用薄層色譜方法對蘇丹Ⅰ、蘇丹Ⅳ、808猩紅、酸性紅73、金橙Ⅱ、檸檬黃、胭脂紅、金胺、新品紅、赤蘚紅等10種色素進行了篩查，結果65批樣品均未發現染色問題。

3.1.2 松香酸摻偽 骨折挫傷膠囊處方中含有醋乳香、醋沒藥、血竭三味樹脂類藥材，針對可能存在松香摻偽問題，采用HPLC法對松香酸進行篩查，結果65批樣品均未檢出松香酸。

3.1.3 重金屬檢測 骨折挫傷膠囊處方中含有礦物藥自然銅，可能產生內源性的重金屬積蓄，處方中的土鱉蟲，也容易導致重金屬超標。因此采用仿人工胃液對制劑進行樣品前處理 ,用ICP-MS法測定20批樣品中鉛、鎘、砷、汞、銅含量。參照WHO推薦的每日最高攝入量限度(以體重60 kg計)，鉛為214 μg、鎘為60 μg、砷為128 μg、汞為43 μg、銅為30 mg。按每日服用量折算各元素值，鉛(Pb)的每日最大攝入量為65 μg，鎘(Cd)的每日最大攝入量為1.45 μg，砷(As)的每日最大攝入量為34 μg，汞(Hg)的每日最大攝入量為8 μg，合格率45%，銅(Cu)的每日最大攝入量為0.2 mg，均未超出WHO的推薦值。

3.2 藥物有效性研究

3.2.1 當歸的薄層色譜鑒別 參考《中國藥典》2015年版(一部)中當歸的薄層鑒別方法并進行優化，建立骨折挫傷膠囊中當歸的薄層鑒別方法。對65批樣品進行檢測，結果63批樣品可清晰檢出當歸，2批樣品未檢出當歸，涉嫌所用藥材質量較差或制劑工藝可能存在問題。典型色譜圖見圖1。

3.2.2 血竭、乳香的薄層色譜鑒別 參考《中國藥典》2015年版(一部)中血竭、乳香及天麻頭痛片的薄層鑒別方法，以血竭對照藥材、乳香對照藥材做對照，對處方中的血竭、乳香進行共薄層鑒別。結果65批樣品均可清晰檢出血竭、乳香，合格率100%。典型色譜圖見圖2。

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3.2.3 紅花、大黃的含量測定 現行標準僅有血竭素含量測定項，無法有效控制制劑的整體質量。探索性研究建立了同時測定紅花、大黃含量的HPLC方法，對8個企業的65批樣品進行檢測。結果不同生產企業的各有效成分含量差異較大，同一生產企業不同批次之間各有效成分含量差異明顯。

3.2.3.1 色譜條件 色譜柱： Agilent Zorbax Bonus-RP C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～13 min，18%A→25%A；13～14 min，25%A→80%A；14～25 min，80%A)；流速1.0 mL·min-1；羥基紅花黃色素A和大黃酚檢測波長為428 nm；柱溫為35 ℃；進樣量10 μL。

3.2.3.2 溶液的制備 混合對照品溶液 取羥基紅花黃色素A對照品、大黃酚對照品適量，精密稱定，加乙醇制成混合對照品儲備液Ⅰ，每1 mL含羥基紅花黃色素A 29.82 μg、大黃酚5.214 μg，精密量取對照品儲備液Ⅰ 5 mL置25 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，得混合對照品溶液Ⅱ，每1 mL含羥基紅花黃色素A 5.964 μg、大黃酚1.043 μg，備用。

3.2.3.3 供試品溶液 取骨折挫傷膠囊10粒的內容物0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率200 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

3.2.3.4 系統適用性試驗 精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10 μL，進樣分析，結果各待測成分與前后峰分離良好，分離度均大于1.5；理論板數以羥基紅花黃色素A、大黃酚峰計算均不低于4 000。

3.2.3.5 線性關系考察 分別精密吸取羥基紅花黃色素A、大黃酚混合對照品溶液及儲備液注入液相色譜儀，測定，以對照品的進樣量(X，μg)為橫坐標，以峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程和相關系數。結果表明，在線性范圍內上述3種有效成分的進樣量與峰面積呈良好的線性關系。詳見表1。

表1 骨折挫傷膠囊中3種成分的回歸方程和線性范圍

3.2.3.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液Ⅱ 10 μL，進樣分析，連續進樣6次，測定2種成分的色譜峰面積，結果羥基紅花黃色素A、大黃酚峰面積的RSD值分別為0.1%、0.8%(n=6)。結果表明儀器精密度良好。

3.2.3.7 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液(企業B，批號：160301)10 μL，分別于配制后0、2、4、8、12、18和24 h進樣測定。結果羥基紅花黃色素A、大黃酚峰面積的RSD值分別為0.3%、0.5%(n=6)，結果表明，供試品溶液在24 h內穩定性良好。

3.2.3.8 重復性試驗 精密稱取同一批號的樣品(企業B，批號：160301)6份，各0.2 g，分別制成供試品溶液，按相應色譜條件測定。結果羥基紅花黃色素A、大黃酚的含量平均值分別為1.138 6、0.250 6 mg·g-1，RSD分別為0.9%、0.4%(n=6)，表明重復性良好。

3.2.3.9 回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品(企業B，批號：160301)0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入羥基紅花黃色素A、大黃酚合對照品溶液I 10 mL，制備回收率樣品溶液，進樣分析，分別計算各成分的回收率及RSD值，羥基紅花黃色素A、大黃酚的平均加樣回收率分別為99.7%、98.7%，RSD分別為0.2%、0.8%(n=6)。

3.2.3.10 樣品測定 取8家生產廠家共65批樣品，制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，以外標法計算樣品中羥基紅花黃色素A、大黃酚的含量，結果見表2。

表2 各生產廠家樣品測定結果統計

企業B生產的骨折挫傷膠囊中羥基紅花黃色素A和大黃酚的平均含量最高，且2種成分含量結果的分布均一性較好；企業A、E、G的樣品中部分成分平均含量較高，但含量結果的分布離散性較大，提示其生產原料或生產工藝穩定性較差；企業C、F、H的樣品批數較少，數據量較少，趨勢不明。

3.3 藥物穩定性研究

3.3.1 血竭素含量測定分析 現行標準規定血竭素的含量不得少于40 μg/粒，對批次在6批以上的企業生產的產品進行統計分析，由圖4可見，各企業產品血竭素含量差異較大，同一企業生產日期較早的產品含量較低，對企業的函調也反饋血竭素含量不穩定，隨貯存時間延長血竭素含量出現明顯的下降趨勢，降解快，部分批次樣品測定結果接近限度值。測定方法重現性不好，存在標準不完善的問題。針對這一問題分析血竭素的結構特點，發現血竭素屬于花青素類化合物(flavylium compounds)，其和報道過的花青素相類似，在溶液中不穩定，隨著溫度、光照及溶液pH值的變化，發生一系列可逆復雜的結構轉變[11-20]，因此根據制劑特點分別考察了提取溶液pH值、混料順序等因素對血竭素穩定性的影響。

3.3.2 提取溶液pH值的影響 分別配制不同濃度的磷酸甲醇溶液作為提取溶劑，并按照現行標準含量測定方法制備骨折挫傷膠囊供試品溶液，測定血竭素的含量，結果見圖5。由圖可見，供試品提取溶劑pH值越低，血竭素的含量測定結果的數值越大。

3.3.3 混料順序對血竭含量測定的影響 除豬骨膠外，處方中的其他9味藥材均為原粉入藥，處方中含有大量動物膠質類、脂肪類、蛋白質類、樹脂類等成分，考慮到處方藥味之間可能存在一定的相互影響作用，故分別考察血竭單獨混合粉碎和與各藥味分別粉碎對血竭含量測定結果的影響。

按處方量，分別取血竭與處方中任一味藥粉碎后，再與其他8味藥的混合細粉混勻。分別于血竭混合粉碎藥味順序為豬骨膠(A1)、炒黃瓜子(A2)、醋乳香與醋沒藥(A3)、當歸(A4)、紅花(A5)、土鱉蟲(A6)、煅自然銅(A7)、大黃混合后粉碎成細粉(A9)，另取血竭單獨粉碎后，再與其他9味藥的混合細粉混勻(A8-1和A8-2)。按照現行執行標準《中國藥典》2015年版(一部)“骨折挫傷膠囊”【含量測定】項方法，分別測定血竭素含量，結果見圖6。

由圖可見，豬骨膠、當歸、紅花、煅自然銅與血竭混粉對血竭素的含量測定結果影響較小；醋乳香、醋沒藥與血竭混粉和土鱉蟲與血竭混粉對血竭素的含量測定結果影響較大；血竭單粉后，測定前與其他藥味混合，含量測定結果的數值最高。分析原因：①醋乳香、醋沒藥與血竭均為樹脂類藥材，在粉碎過程中可能產生互相包裹，影響提取效率；②考慮到各藥味在處方中的占比，土鱉蟲對含量測定結果影響最大，這可能與不法商家為給土鱉蟲增重，喂食生石灰、水泥等堿性物質有關，血竭素在堿性作用下會產生化學結構變化，最終導致含量測定結果數值大幅下降。因此建議企業在制劑過程中血竭藥材采用單獨粉碎后再與其他藥味混料。

4 總結與討論

根據法定標準檢驗和探索性研究結果，對骨折挫傷膠囊進行較為全面的分析，從藥品安全性、有效性、穩定性方面進行研究，建立相關方法進行評價，整體評價骨折挫傷膠囊質量較好，但存在檢測指標穩定性差、限度值有待商榷、同一企業批間差異較大、不同企業一致性不佳等問題。

針對發現的問題，提出以下建議：①加強生產全鏈條控制，嚴把藥材質量，對生產工藝進行進一步優化，對上市后產品穩定性進行深入研究；②進行標準提升，增加必要的安全性、有效性檢驗項目，加強產品整體質量控制，確保產品質量。