高壓靜電場(chǎng)脅迫對(duì)甘草生長(zhǎng)過(guò)程中RNA的影響

李倩 郭九峰 高海榮

摘要：為探究高壓靜電場(chǎng)對(duì)甘草生長(zhǎng)過(guò)程中RNA含量的影響，本試驗(yàn)以甘草幼葉、嫩莖和種子為研究材料，依次采用十二烷基苯磺酸鈉（SDS）法、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、異硫氰酸胍（Trizol）法提取甘草幼葉、嫩莖、種子的RNA，并進(jìn)行比較分析。并通過(guò)紫外分光光度法，分析檢測(cè)經(jīng)不同強(qiáng)度高壓靜電場(chǎng)（0、12、15、18 kV）處理之后生長(zhǎng)過(guò)程中甘草不同組織RNA含量。結(jié)果表明，3種方法均能從甘草中提取出RNA。SDS法是適用于甘草組織RNA提取的最佳方法。經(jīng)不同強(qiáng)度高壓靜電場(chǎng)處理，甘草RNA含量增加，降解含量降低。高壓靜電場(chǎng)影響最明顯的是處理電場(chǎng)強(qiáng)度為18 kV時(shí)，甘草生長(zhǎng)9 d時(shí)，RNA含量最高。本研究初步探究了高壓靜電場(chǎng)對(duì)甘草生長(zhǎng)過(guò)程中RNA含量的影響，為甘草RNA的研究和高壓靜電場(chǎng)與分子生物學(xué)的研究提供了基礎(chǔ)參考。

關(guān)鍵詞：甘草;高壓靜電場(chǎng);RNA提取;SDS法;RNA含量

中圖分類號(hào)：S567.7+10.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2020）13-0076-04

收稿日期：2019-08-10

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：51467014）。

作者簡(jiǎn)介：李倩（1993—），女，河北張家口人，碩士，主要從事環(huán)境生物物理和分子技術(shù)研究。E-mail：934192500@qq.com。

通信作者：郭九峰，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事生物物理與生物技術(shù)研究。E-mail：guojf101@sina.com。甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）作為我國(guó)傳統(tǒng)的大宗中藥材，本身也是一種可綜合利用的經(jīng)濟(jì)型植物。但迄今為止，有關(guān)甘草不同組織總RNA的提取報(bào)道甚少。這主要是由于甘草葉片、莖干中蛋白質(zhì)、脂肪、多糖等含量均很高，刺毛狀腺體中還含有大量黏液質(zhì)[1]。根和根莖中有甘草酸等豐富的次生代謝產(chǎn)物，致使提取甘草的RNA比一般的植物要困難，通過(guò)這些方法提取的RNA多適用于后期的逆轉(zhuǎn)錄PCR（PT-PCR）等試驗(yàn)，很少用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[1-3]。針對(duì)這類植物，相關(guān)學(xué)者通過(guò)調(diào)整試驗(yàn)方式，結(jié)合不同方法以及加入不同的物質(zhì)來(lái)提高植物RNA的提取率，例如陳華等使用改良Trizol法結(jié)合LiCl法提取了番茄葉片的RNA[4]。

高壓靜電技術(shù)是近幾十年興起的一種重要的處理種子的方法[5]。利用其能夠擊穿組織細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的特征，從而提高種子的活化能，調(diào)節(jié)內(nèi)部水分子、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）含量、酶活性等，優(yōu)化原有性質(zhì)，增強(qiáng)種子的生理生化反應(yīng)[6-7]，提高種子活力，與此同時(shí)降低植物的發(fā)病率并提高其抗逆能力[8]。本試驗(yàn)以甘草幼葉、嫩莖、種子為材料，選用十二烷基苯磺酸鈉（SDS）法、Trizol法、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取總RNA，期望找到一種提取甘草RNA的最佳方法，并能達(dá)到轉(zhuǎn)錄測(cè)序要求，并探究高壓靜電場(chǎng)對(duì)甘草RNA含量的影響，以便為后續(xù)相關(guān)分子水平研究提供科學(xué)參考。

1材料與方法

1.1材料及處理采集

1.1.1試劑材料甘草種子，選用人工栽培的烏拉爾甘草，購(gòu)自內(nèi)蒙古赤峰生態(tài)甘草種植基地;甘草完整苗株取自筆者所在課題組實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)的甘草苗。供試試劑：Trizol[天根生化科技（北京）有限公司]，CTAB、焦碳酸二乙酯（DEPC）、SDS、酚-三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、乙醇、無(wú)RNA酶水（內(nèi)蒙古鴻之惠商貿(mào)有限公司）。

1.1.2材料處理挑選飽滿的甘草種子，于98%濃硫酸溶液中處理10 min，用無(wú)菌水洗滌3～4次，洗凈種子表面殘留酸液，晾干。將經(jīng)濃硫酸處理過(guò)的種子分成若干份，進(jìn)行高壓靜電場(chǎng)處理。高壓靜電場(chǎng)電壓的選取是在筆者所在課題組研究基礎(chǔ)上進(jìn)行篩選的，電壓依次為0（CK）、12、15、18 kV，處理時(shí)間為 25 min（CK處理為0 min）。高壓靜電場(chǎng)處理完之后，置于10%次氯酸鈉溶液中15 min，用無(wú)菌水洗滌數(shù)次，晾干備用。播種于MS培養(yǎng)基中

表明提取的總RNA完整性好。CTAB法得到的凝膠電泳圖譜中，幼葉的整體效果不錯(cuò)，但嫩莖的條帶有些許彌散，可能是DNA污染造成的;種子的條帶完整但亮度偏暗，可能是沉降過(guò)程不完全所致，或有其他物質(zhì)輕微干擾所致。Trizol法提取甘草幼葉、嫩莖和種子總RNA過(guò)程中，出現(xiàn)溶液褐化現(xiàn)象，幼葉的最終提取產(chǎn)物中稍有影響，但整體影響不大。而嫩莖和種子中RNA存在量微乎其微，整體完整性略低，質(zhì)量差。因此，通過(guò)3種方法分析比較，SDS法是提取甘草RNA的最佳方法。

2.2SDS法提取不同高壓靜電場(chǎng)處理甘草苗的RNA檢測(cè)

采用SDS法提取經(jīng)由不同高壓靜電場(chǎng)處理的甘草苗的RNA，電泳結(jié)果見圖4，條帶清晰、明亮。18 kV和CK條件下（泳道3和泳道4）條帶孔位有些明亮，考慮可能有沉淀未洗脫完全。經(jīng)電場(chǎng)處理的泳道條帶比CK清晰明亮，說(shuō)明經(jīng)高壓靜電場(chǎng)處理對(duì)甘草RNA的提取起到了一定的促進(jìn)作用。

2.3SDS法的PCR驗(yàn)證

采用SDS法得到的不同高壓靜電場(chǎng)處理的甘幼葉、嫩莖和種子RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以RT-PCR得到的第一鏈CDNA作為模板，以甘草Actin基因設(shè)計(jì)引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖5。不同高壓靜電場(chǎng)處理的甘草的幼葉、嫩莖和種子都出現(xiàn)了目的條帶，擴(kuò)增效果理想，條帶清晰明顯，沒(méi)有一點(diǎn)拖帶，進(jìn)一步說(shuō)明SDS法是甘草RNA提取的最佳方法，同時(shí)高壓靜電場(chǎng)的加入也優(yōu)化了高質(zhì)量RNA的獲得。

2.4RNA含量與電場(chǎng)強(qiáng)度的關(guān)系

使用SDS法提取甘草種子經(jīng)電場(chǎng)處理和對(duì)照組分別生長(zhǎng)1、3、5、7、9、11 d的RNA，檢測(cè)不同高壓靜電場(chǎng)對(duì)甘草RNA的影響（圖6）。

不同高壓靜電場(chǎng)處理在不同生長(zhǎng)時(shí)間里，RNA含量呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，經(jīng)高壓靜電場(chǎng)處理的RNA含量出現(xiàn)不同程度的波動(dòng)變化，在15、18 kV條件下整體波動(dòng)上升，12 kV條件下，在一定范圍之內(nèi)波動(dòng)下降，而CK組出現(xiàn)大范圍波動(dòng)下降。隨著電場(chǎng)強(qiáng)度增加，RNA的含量也出現(xiàn)波動(dòng)變化，綜合觀察來(lái)看，當(dāng)處理所用高壓靜電場(chǎng)強(qiáng)度為18 kV時(shí)，甘草生長(zhǎng)到9 d時(shí)，RNA含量最大，并且此時(shí)RNA降解量最少。因此，確定 18 kV 為最佳電場(chǎng)強(qiáng)度。

3討論與結(jié)論

純度高、完整性好的RNA是進(jìn)行RT-PCR、熒光定量Real-time PCR、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、基因表達(dá)分析等的基礎(chǔ)[22-23]。甘草是一種經(jīng)濟(jì)型綜合利用的植物，由于其本身有大量蛋白質(zhì)、多糖，莖葉的刺毛狀腺體中還含有大量黏液質(zhì)，根和根莖中又有豐富的

次生代謝產(chǎn)物，提取甘草RNA面臨一定的困難。Trizol法是一種簡(jiǎn)單快速提取RNA的方法，試驗(yàn)中溶液褐化現(xiàn)象，可能與試劑中含有氧化性物質(zhì)有關(guān)，在去除雜質(zhì)的同時(shí)也會(huì)造成RNA的損失，所以Trizol法不適合甘草這類植物RNA的提取。CTAB法能夠摒棄試驗(yàn)過(guò)程中的部分氧化還原情況，但是其操作復(fù)雜，操作過(guò)程溫度區(qū)間涉及廣，容易造成降解。因此，并不是提取甘草RNA的最佳方法。SDS法既能克服Trizol法的一些弊端，又比CTAB法操作簡(jiǎn)單，且成本不高，能夠獲得高質(zhì)量的RNA。因此，SDS法是甘草不同組織RNA提取的最佳選擇。高壓靜電場(chǎng)是近幾十年來(lái)興起的且用途廣泛的一門技術(shù)[5]，本試驗(yàn)通過(guò)加入高壓靜電場(chǎng)的處理，結(jié)果表明，甘草組織中RNA的獲得率確有提高，說(shuō)明高壓靜電場(chǎng)處理促進(jìn)了RNA的提取。目前為止，有關(guān)電場(chǎng)對(duì)植物的處理效應(yīng)詳盡的機(jī)制尚未有明確的定論，可能的分析方向類型有細(xì)胞膜電穿孔模型、電崩解模型、影響酶的活性[24-27]、影響遺傳物質(zhì)[28-29]等。本研究結(jié)果表明，高壓靜電場(chǎng)處理甘草之后，組織中RNA發(fā)生了明顯的變化，這也驗(yàn)證了高壓靜電場(chǎng)影響遺傳物質(zhì)的說(shuō)法。

本試驗(yàn)研究了不同RNA提取方法對(duì)甘草的適用性，并以此為基礎(chǔ)探究高壓靜電場(chǎng)處理對(duì)甘草生長(zhǎng)過(guò)程中RNA含量的影響。存在于自然界的所有生物體都擁有特異的生理特性和電磁效應(yīng)，試驗(yàn)證明，高壓靜電場(chǎng)處理對(duì)甘草RNA的提取有促進(jìn)作用，這可能也為高質(zhì)量RNA的獲得提供一種可能。想要全面、深層次地探究高壓靜電場(chǎng)對(duì)甘草RNA的影響機(jī)制，未來(lái)學(xué)者可以以此為切入點(diǎn)從不同層次進(jìn)行探究。

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