清熱解毒扶正顆粒對PI3K/Akt/NF-κB信號通路的影響

韋袞政 韋莽 萬啟南 李瓊鋒 祁燕 李帥 崔彧

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)是一種嚴重危害人類健康的常見病、多發病，是一種以持續氣流受限為特征的氣道與肺部疾病，與氣道和肺組織對煙草煙霧等有害氣體或有害顆粒的慢性炎癥反應增強有關，以肺實質的破壞和氣道炎癥為主要病理特征[1]。蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)是磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K)信號通路中的關鍵信號轉導分子。當PI3K被氧化應激、生長因子等細胞表面受體激活后，并最終導致Akt的活化[2-4]，從而激活或抑制其下游靶蛋白如轉錄核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)等，導致炎癥的級聯反應[5]。PI3K/Akt信號通路可通過調控炎性介質釋放、炎癥細胞活化及氣道重構等參與COPD氣道炎癥反應過程。清熱扶正顆粒是在中醫的整體觀念指導下，從整體上把握疾病“證”的變化，制定出以扶正祛邪為治療原則，以清熱解毒、涼血化瘀、益氣養陰為治法的復方中藥制劑，對炎癥性疾病有較好的療效[6-7]。本實驗從PI3K/Akt/NF-κB信號通路探討清熱扶正顆粒對COPD的部分作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

兩月齡Wistar大鼠90只，體重(200±20) g，購自成都達碩實驗動物有限公司。動物生產許可證號：SYXK(滇)K2013-007。

1.2 動物分組與造模

用隨機數字表法將90只大鼠隨機分為6組，即正常對照組、模型組、清熱解毒扶正顆粒低劑量組、清熱解毒扶正顆粒中劑量組、清熱解毒扶正顆粒高劑量組、阿奇霉素組。

除正常對照組外，其他各組大鼠置于1 m×1 m×1 m的煙室中，香煙(焦油量約為12 mg，煙氣煙堿量約為1.1 mg，約燒50支香煙)煙熏，每日30分鐘(氣管內注射當日停止煙熏)。第1和14天將其仰臥位固定在老鼠板上，固定四肢、頭部，用開鼻器撬開動物口，將舌輕輕拉出，壓迫舌腹，暴露喉頭，在電子支氣管鏡注視下，趁動物吸氣的瞬間，迅速將與1 mL注射器相連的針頭9號腰穿針插入氣管，約達氣管分叉處，緩慢注入脂多糖內毒素(lipopolysaccharide，LPS)200 μg/200 μL，正常對照組氣管內用藥當日注入等量的生理鹽水(200 μL)。煙熏連續28天。

1.3 供試藥品

清熱解毒扶正顆粒成人處方：翼首草30 g、荷葉頂15 g、連翹15 g、魚腥草30 g、 柴胡10 g、 葛根15 g、蘆根15 g、太子參30 g、麥冬10 g、生地30 g、知母15 g、牡丹皮15 g、薏苡仁30 g、甘草10 g組成。由云南省中醫醫院制劑中心按方案配制成顆粒。阿奇霉素片由上海天龍藥業有限公司提供。

1.4 動物給藥

清熱解毒扶正顆粒低、中、高劑量組，分別給予清熱解毒扶正顆粒(相當于生藥量)1.87 g/mL、3.74 g/mL、7.48 g/mL；阿奇霉素組給予3.4 mg/mL；模型對照組及正常對照組給予生理鹽水，用量均按1 mL/100g鼠重灌胃，每天2次，連續28天。

1.5 實驗試劑

TNF-α ELISA 試劑盒(批號：20190318A)、MMP-9 ELISA 試劑盒(批號：20180318B)、TIMP-1 ELISA 試劑盒(批號：20180318C)由江蘇卡爾文生物科技有限公司提供。Phospho-Akt抗體(貨號：4060)、Phospho-NF-κB-1抗體(貨號：4806)由美國CST公司提供，Phospho-PI3K抗體(貨號：ab182651)由abcam公司提供。

1.6 實驗儀器

ABI 7900 Real-time PCR儀(美國ABI公司)，BIORAD 電泳儀(美國BIO-RAD公司)，超微量核酸蛋白檢測儀(北京眾力挽生物科技有限公司)，美國EPOCH酶標儀。

1.7 Elisa檢測

設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL；樣本孔先加待測樣本10 μL再加樣本稀釋液40 μL；除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴恒溫箱溫育60分鐘。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1分鐘，重復洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15分鐘。加入終止液50 μL，15分鐘內，在450 nm波長處測定各孔的OD值。依據曲線方程計算各樣本濃度值。

1.8 Western Blot檢測

各組取20 μL蛋白樣品及對照蛋白，10%SDS-PAGE電泳(60V～120V)；90V轉膜1.5小時，將分離膠上的蛋白樣品轉移至硝酸纖維素薄膜上，剪下目的蛋白條帶，放入封閉液(5%脫脂奶粉)中室溫封閉1小時；加入對應一抗，于脫色搖床上4℃搖擺過夜；TBST溶液反復洗膜5次，每次5分鐘，然后加入二抗孵育，脫色搖床上室溫輕搖60分鐘；TBST溶液反復洗膜5次，每次5分鐘。最后于Odyssey CLx紅外熒光掃描成像系統檢測蛋白表達。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 血清TNF-α、MMP-9、TIMP-1水平

通過ELISA檢測，造模后大鼠血清的TNF-α、TIMP-1、MMP-9均不同程度的升高，與空白對照組相比較，TNF-α、MMP-9升高有顯著性差異(P<0.05)，TIMP-1升高無顯著性差異(P>0.05)。經清熱解毒扶正顆粒灌胃治療后，大鼠血清的TNF-α、TIMP-1、MMP-9均不同程度的降低，與模型組相比較，清熱解毒扶正顆粒低、中、高劑量組顯著降低TNF-α水平(P<0.01)；清熱解毒扶正顆粒中劑量組顯著降低TIMP-1水平(P<0.01)，清熱解毒扶正顆粒高劑量組顯著降低TIMP-1水平(P<0.05)，清熱解毒扶正顆粒低劑量組降低TIMP-1水平不顯著(P>0.05)；清熱解毒扶正顆粒低、中、高劑量組降低MMP-9水平不顯著(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清TNF-α、MMP-9、TIMP-1水平比較

圖1 磷酸化Akt、NF-κB-1、PI3K蛋白免疫印跡條帶圖

2.2 肺組織磷酸化Akt、NF-κB-1、PI3K蛋白表達

通過Western Blot檢測，造模后磷酸化Akt、NF-κB-1、PI3K蛋白表達不同程度地增高，與正常對照比較，模型組增高有顯著性差異(P<0.05)。經清熱解毒扶正顆粒灌胃治療后，與模型組相比較，清熱解毒扶正顆粒高劑量組顯著降低磷酸化Akt、NF-κB-1、PI3K蛋白表達水平(P<0.05)；清熱解毒扶正顆粒中劑量組顯著降低磷酸化Akt蛋白表達水平(P<0.05)，清熱解毒扶正顆粒低劑量組對磷酸化Akt作用不顯著(P>0.05)；清熱解毒扶正顆粒中劑量組、低劑量組對磷酸化NF-κB-1、PI3K蛋白表達作用不顯著(P>0.05)。見表2、圖1。

表2 各組大鼠肺組織磷酸化Akt、NF-κB-1、PI3K蛋白表達比較

3 討論

PI3K是催化磷酸肌醇3-OH端磷酸化的一類蛋白質家族，當PI3K被氧化應激、生長因子等細胞表面受體激活后，在質膜上產生第二信使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol-3,4, 5-triphosphate,PIP3)，PIP3與細胞內含有PH結構域的信號蛋白Akt和磷脂酰激酶依賴激酶1(phosphatidykinase dependent kinase 1,PDK1)結合，促使PDK1磷酸化Akt蛋白，并最終導致Akt的活化[8]。活化的Akt可通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，促使核因子NF-κB發生核轉位，使NF-κB的P65亞基磷酸化，增加其轉錄活性[9-10]。NF-κB是一種轉錄調節因子，可調控多種炎癥因子基因的轉錄，細胞內NF-κB信號通路參與炎癥反應、免疫反應、病毒復制、細胞凋亡和增殖的多種基因的表達調控，在調節炎癥反應的基因中起關鍵作用。相關研究表明，轉錄因子NF-кB參與COPD多種炎癥介質的調控，其中包括白細胞介素(interleulein,IL)-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、LTB4、MIP、ICAM-1、NOS-2等細胞因子，NF-кB通過引導這些炎癥介質的表達，參與肺部炎癥的免疫反應[11]。系列炎癥過程中同時產生彈性蛋白酶、基質金屬蛋白酶(extracellular matrix,MMPs)等多種酶破壞降解氣道及肺泡細胞外基質(extracellular matrix,ECM)。而基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)和金屬蛋白酶組織抑制因子(matrix metalloproteinases,TIMPs)是調節肺泡ECM降解與合成的主要酶類。TIMPs是一組能夠抑制MMPs活性的糖蛋白，可由巨噬細胞、內皮細胞、成纖維細胞及腫瘤細胞合成分泌，并以可溶性的形式分泌到ECM中，通過阻礙MMPs的酶原自我激活及特異性地與MMP-9催化活性中心的鋅離子結合形成穩定的復合體抑制其活性。一般認為，MMP-9/TIMP-1比值升高表明氣道以炎癥為主，將導致組織破壞，形成肺氣腫；MMP-9/TIMP-1比值下降表明氣道以修復為主，將導致ECM過度沉積，氣道發生重構[12-13]。PI3K/Akt/NF-кB信號通路可通過調控炎性介質釋放、炎癥細胞活化及氣道重構等在氣道慢性炎性疾病中起著重要作用。

清熱解毒扶正顆粒以扶正祛邪為治療原則，以清熱解毒、涼血化瘀、益氣養陰為治法的驗方。實驗研究表明，清熱解毒扶正顆粒有明顯降低內毒素致高熱家兔的C-反應蛋白、IL-1β、IL-12的水平[6,14-15]，抑制內毒素大鼠肺腎組織NF-κB p65蛋白表達水平[16]。臨床研究表明，清熱解毒扶正顆粒能明顯降低老年肺炎患者升高的體液免疫指標；降低升高的血白細胞、血清降鈣素原、C反應蛋白水平，有顯著的抗感染作用[6，17]。能降低慢性阻塞性肺疾病患者的二氧化碳分壓，提高其氧分壓，對外感高熱、肺炎、慢性阻塞性肺疾病等具有較好的療效。

本研究表明，清熱解毒扶正顆粒顯著降低大鼠血清的TNF-α水平；顯著降低血清TIMP-1水平，劑量依賴性；對血清MMP-9水平無顯著影響，但能提高MMP-9/TIMP-1比值，顯著降低肺組織磷酸化Akt、NF-κB-1、PI3K蛋白表達水平，有劑量依賴性。清熱解毒扶正顆粒對抑制TIMP-1的作用強于抑制MMP-9，其作用機制傾向于促進病變組織ECM的降解，減少ECM沉積，減少肺泡壁、氣道的損害，有利于肺組織、氣道損傷的修復。基于扶正祛邪理論立法的清熱解毒扶正顆粒能有效降低炎性因子水平，抑制炎性激活的Akt、NF-κB-1、PI3K蛋白表達水平，抑制炎癥反應，其抗炎機制對PI3K/Akt/NF-κB信號通路有一定的調理作用，其作用位點是復合的多靶位的，具體靶向調控機制有待進一步研究。