清熱解毒扶正顆粒對(duì)PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路的影響

韋袞政 韋莽 萬啟南 李瓊鋒 祁燕 李帥 崔彧

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病、多發(fā)病，是一種以持續(xù)氣流受限為特征的氣道與肺部疾病，與氣道和肺組織對(duì)煙草煙霧等有害氣體或有害顆粒的慢性炎癥反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)，以肺實(shí)質(zhì)的破壞和氣道炎癥為主要病理特征[1]。蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)是磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K)信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。當(dāng)PI3K被氧化應(yīng)激、生長(zhǎng)因子等細(xì)胞表面受體激活后，并最終導(dǎo)致Akt的活化[2-4]，從而激活或抑制其下游靶蛋白如轉(zhuǎn)錄核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)等，導(dǎo)致炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[5]。PI3K/Akt信號(hào)通路可通過調(diào)控炎性介質(zhì)釋放、炎癥細(xì)胞活化及氣道重構(gòu)等參與COPD氣道炎癥反應(yīng)過程。清熱扶正顆粒是在中醫(yī)的整體觀念指導(dǎo)下，從整體上把握疾病“證”的變化，制定出以扶正祛邪為治療原則，以清熱解毒、涼血化瘀、益氣養(yǎng)陰為治法的復(fù)方中藥制劑，對(duì)炎癥性疾病有較好的療效[6-7]。本實(shí)驗(yàn)從PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路探討清熱扶正顆粒對(duì)COPD的部分作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

兩月齡Wistar大鼠90只，體重(200±20) g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(滇)K2013-007。

1.2 動(dòng)物分組與造模

用隨機(jī)數(shù)字表法將90只大鼠隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組、模型組、清熱解毒扶正顆粒低劑量組、清熱解毒扶正顆粒中劑量組、清熱解毒扶正顆粒高劑量組、阿奇霉素組。

除正常對(duì)照組外，其他各組大鼠置于1 m×1 m×1 m的煙室中，香煙(焦油量約為12 mg，煙氣煙堿量約為1.1 mg，約燒50支香煙)煙熏，每日30分鐘(氣管內(nèi)注射當(dāng)日停止煙熏)。第1和14天將其仰臥位固定在老鼠板上，固定四肢、頭部，用開鼻器撬開動(dòng)物口，將舌輕輕拉出，壓迫舌腹，暴露喉頭，在電子支氣管鏡注視下，趁動(dòng)物吸氣的瞬間，迅速將與1 mL注射器相連的針頭9號(hào)腰穿針插入氣管，約達(dá)氣管分叉處，緩慢注入脂多糖內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)200 μg/200 μL，正常對(duì)照組氣管內(nèi)用藥當(dāng)日注入等量的生理鹽水(200 μL)。煙熏連續(xù)28天。

1.3 供試藥品

清熱解毒扶正顆粒成人處方：翼首草30 g、荷葉頂15 g、連翹15 g、魚腥草30 g、 柴胡10 g、 葛根15 g、蘆根15 g、太子參30 g、麥冬10 g、生地30 g、知母15 g、牡丹皮15 g、薏苡仁30 g、甘草10 g組成。由云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心按方案配制成顆粒。阿奇霉素片由上海天龍藥業(yè)有限公司提供。

1.4 動(dòng)物給藥

清熱解毒扶正顆粒低、中、高劑量組，分別給予清熱解毒扶正顆粒(相當(dāng)于生藥量)1.87 g/mL、3.74 g/mL、7.48 g/mL；阿奇霉素組給予3.4 mg/mL；模型對(duì)照組及正常對(duì)照組給予生理鹽水，用量均按1 mL/100g鼠重灌胃，每天2次，連續(xù)28天。

1.5 實(shí)驗(yàn)試劑

TNF-α ELISA 試劑盒(批號(hào)：20190318A)、MMP-9 ELISA 試劑盒(批號(hào)：20180318B)、TIMP-1 ELISA 試劑盒(批號(hào)：20180318C)由江蘇卡爾文生物科技有限公司提供。Phospho-Akt抗體(貨號(hào)：4060)、Phospho-NF-κB-1抗體(貨號(hào)：4806)由美國CST公司提供，Phospho-PI3K抗體(貨號(hào)：ab182651)由abcam公司提供。

1.6 實(shí)驗(yàn)儀器

ABI 7900 Real-time PCR儀(美國ABI公司)，BIORAD 電泳儀(美國BIO-RAD公司)，超微量核酸蛋白檢測(cè)儀(北京眾力挽生物科技有限公司)，美國EPOCH酶標(biāo)儀。

1.7 Elisa檢測(cè)

設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；樣本孔先加待測(cè)樣本10 μL再加樣本稀釋液40 μL；除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴恒溫箱溫育60分鐘。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1分鐘，重復(fù)洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15分鐘。加入終止液50 μL，15分鐘內(nèi)，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。依據(jù)曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

1.8 Western Blot檢測(cè)

各組取20 μL蛋白樣品及對(duì)照蛋白，10%SDS-PAGE電泳(60V～120V)；90V轉(zhuǎn)膜1.5小時(shí)，將分離膠上的蛋白樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜上，剪下目的蛋白條帶，放入封閉液(5%脫脂奶粉)中室溫封閉1小時(shí)；加入對(duì)應(yīng)一抗，于脫色搖床上4℃搖擺過夜；TBST溶液反復(fù)洗膜5次，每次5分鐘，然后加入二抗孵育，脫色搖床上室溫輕搖60分鐘；TBST溶液反復(fù)洗膜5次，每次5分鐘。最后于Odyssey CLx紅外熒光掃描成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清TNF-α、MMP-9、TIMP-1水平

通過ELISA檢測(cè)，造模后大鼠血清的TNF-α、TIMP-1、MMP-9均不同程度的升高，與空白對(duì)照組相比較，TNF-α、MMP-9升高有顯著性差異(P<0.05)，TIMP-1升高無顯著性差異(P>0.05)。經(jīng)清熱解毒扶正顆粒灌胃治療后，大鼠血清的TNF-α、TIMP-1、MMP-9均不同程度的降低，與模型組相比較，清熱解毒扶正顆粒低、中、高劑量組顯著降低TNF-α水平(P<0.01)；清熱解毒扶正顆粒中劑量組顯著降低TIMP-1水平(P<0.01)，清熱解毒扶正顆粒高劑量組顯著降低TIMP-1水平(P<0.05)，清熱解毒扶正顆粒低劑量組降低TIMP-1水平不顯著(P>0.05)；清熱解毒扶正顆粒低、中、高劑量組降低MMP-9水平不顯著(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清TNF-α、MMP-9、TIMP-1水平比較

圖1 磷酸化Akt、NF-κB-1、PI3K蛋白免疫印跡條帶圖

2.2 肺組織磷酸化Akt、NF-κB-1、PI3K蛋白表達(dá)

通過Western Blot檢測(cè)，造模后磷酸化Akt、NF-κB-1、PI3K蛋白表達(dá)不同程度地增高，與正常對(duì)照比較，模型組增高有顯著性差異(P<0.05)。經(jīng)清熱解毒扶正顆粒灌胃治療后，與模型組相比較，清熱解毒扶正顆粒高劑量組顯著降低磷酸化Akt、NF-κB-1、PI3K蛋白表達(dá)水平(P<0.05)；清熱解毒扶正顆粒中劑量組顯著降低磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，清熱解毒扶正顆粒低劑量組對(duì)磷酸化Akt作用不顯著(P>0.05)；清熱解毒扶正顆粒中劑量組、低劑量組對(duì)磷酸化NF-κB-1、PI3K蛋白表達(dá)作用不顯著(P>0.05)。見表2、圖1。

表2 各組大鼠肺組織磷酸化Akt、NF-κB-1、PI3K蛋白表達(dá)比較

3 討論

PI3K是催化磷酸肌醇3-OH端磷酸化的一類蛋白質(zhì)家族，當(dāng)PI3K被氧化應(yīng)激、生長(zhǎng)因子等細(xì)胞表面受體激活后，在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol-3,4, 5-triphosphate,PIP3)，PIP3與細(xì)胞內(nèi)含有PH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白Akt和磷脂酰激酶依賴激酶1(phosphatidykinase dependent kinase 1,PDK1)結(jié)合，促使PDK1磷酸化Akt蛋白，并最終導(dǎo)致Akt的活化[8]。活化的Akt可通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，促使核因子NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)位，使NF-κB的P65亞基磷酸化，增加其轉(zhuǎn)錄活性[9-10]。NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可調(diào)控多種炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、病毒復(fù)制、細(xì)胞凋亡和增殖的多種基因的表達(dá)調(diào)控，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的基因中起關(guān)鍵作用。相關(guān)研究表明，轉(zhuǎn)錄因子NF-кB參與COPD多種炎癥介質(zhì)的調(diào)控，其中包括白細(xì)胞介素(interleulein,IL)-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、LTB4、MIP、ICAM-1、NOS-2等細(xì)胞因子，NF-кB通過引導(dǎo)這些炎癥介質(zhì)的表達(dá)，參與肺部炎癥的免疫反應(yīng)[11]。系列炎癥過程中同時(shí)產(chǎn)生彈性蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶(extracellular matrix,MMPs)等多種酶破壞降解氣道及肺泡細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)。而基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)和金屬蛋白酶組織抑制因子(matrix metalloproteinases,TIMPs)是調(diào)節(jié)肺泡ECM降解與合成的主要酶類。TIMPs是一組能夠抑制MMPs活性的糖蛋白，可由巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞合成分泌，并以可溶性的形式分泌到ECM中，通過阻礙MMPs的酶原自我激活及特異性地與MMP-9催化活性中心的鋅離子結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合體抑制其活性。一般認(rèn)為，MMP-9/TIMP-1比值升高表明氣道以炎癥為主，將導(dǎo)致組織破壞，形成肺氣腫；MMP-9/TIMP-1比值下降表明氣道以修復(fù)為主，將導(dǎo)致ECM過度沉積，氣道發(fā)生重構(gòu)[12-13]。PI3K/Akt/NF-кB信號(hào)通路可通過調(diào)控炎性介質(zhì)釋放、炎癥細(xì)胞活化及氣道重構(gòu)等在氣道慢性炎性疾病中起著重要作用。

清熱解毒扶正顆粒以扶正祛邪為治療原則，以清熱解毒、涼血化瘀、益氣養(yǎng)陰為治法的驗(yàn)方。實(shí)驗(yàn)研究表明，清熱解毒扶正顆粒有明顯降低內(nèi)毒素致高熱家兔的C-反應(yīng)蛋白、IL-1β、IL-12的水平[6,14-15]，抑制內(nèi)毒素大鼠肺腎組織NF-κB p65蛋白表達(dá)水平[16]。臨床研究表明，清熱解毒扶正顆粒能明顯降低老年肺炎患者升高的體液免疫指標(biāo)；降低升高的血白細(xì)胞、血清降鈣素原、C反應(yīng)蛋白水平，有顯著的抗感染作用[6，17]。能降低慢性阻塞性肺疾病患者的二氧化碳分壓，提高其氧分壓，對(duì)外感高熱、肺炎、慢性阻塞性肺疾病等具有較好的療效。

本研究表明，清熱解毒扶正顆粒顯著降低大鼠血清的TNF-α水平；顯著降低血清TIMP-1水平，劑量依賴性；對(duì)血清MMP-9水平無顯著影響，但能提高M(jìn)MP-9/TIMP-1比值，顯著降低肺組織磷酸化Akt、NF-κB-1、PI3K蛋白表達(dá)水平，有劑量依賴性。清熱解毒扶正顆粒對(duì)抑制TIMP-1的作用強(qiáng)于抑制MMP-9，其作用機(jī)制傾向于促進(jìn)病變組織ECM的降解，減少ECM沉積，減少肺泡壁、氣道的損害，有利于肺組織、氣道損傷的修復(fù)。基于扶正祛邪理論立法的清熱解毒扶正顆粒能有效降低炎性因子水平，抑制炎性激活的Akt、NF-κB-1、PI3K蛋白表達(dá)水平，抑制炎癥反應(yīng)，其抗炎機(jī)制對(duì)PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路有一定的調(diào)理作用，其作用位點(diǎn)是復(fù)合的多靶位的，具體靶向調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。