血瘀質非創傷性股骨頭壞死miRNA差異表達篩選及生物信息學分析

周明旺，李盛華，鄧昶，付志斌，吉星，陳彥同，胡星榮，劉一飛，王鵬志，趙秋玥

血瘀質非創傷性股骨頭壞死miRNA差異表達篩選及生物信息學分析

周明旺1，李盛華1，鄧昶2，付志斌1，吉星1，陳彥同2，胡星榮2，劉一飛2，王鵬志2，趙秋玥2

1.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫藥大學中醫臨床學院，甘肅 蘭州 730000

篩選血瘀質、非血瘀質非創傷性股骨頭壞死（NONFH）患者與健康人外周血中差異表達的miRNA，建立miRNA表達譜，分析其生物學信息，為血瘀質NONFH的防治提供依據。選取血瘀質、非血瘀質NONFH患者各10例（NONFH組）和健康志愿者8例（正常組），采用RT-PCR檢測其血漿miRNA相對表達量，篩選差異表達的miRNA。應用實時熒光定量PCR對差異表達的hsa-miR-365a-3p、hsa-miR-483-3p進行驗證。采用TargetScan、microRNAorg、PITA在線數據庫對差異miRNA進行靶基因預測，并進行靶基因生物信息學分析。與正常組比較，NONFH組有差異表達的miRNA 50個，其中上調21個，下調29個。與非血瘀質NONFH組比較，血瘀質NONFH組有差異表達的miRNA 33個，其中上調10個，下調23個。經篩選，最終確定血瘀質NONFH差異表達miRNA 5個。實時熒光定量PCR驗證結果與miRNA芯片結果相符。3個在線數據庫共篩選出交集靶基因11個，僅表達下調miRNA中hsa-miR-365a-3p檢出交集靶基因11個，余未檢測出交集靶基因。GO分析顯示，差異表達miRNA主要與受體結合、蛋白及酶的活性有關。Pathway分析顯示，血瘀質NONFH差異表達miRNA靶基因主要富集于軸突導向、Rap1、賴氨酸降解、Fc epsilon RI、甘油磷脂代謝、T細胞受體、血小板活化、成骨細胞分化等多個信號通路。血瘀質NONFH差異表達miRNA可能通過調控Rap1、賴氨酸降解、甘油磷脂代謝、血小板活化、成骨細胞分化、Ras、PI3K-Akt等信號通路參與NONFH發生發展過程。

血瘀質；非創傷性股骨頭壞死；miRNA；基因芯片；生物信息學

非創傷性股骨頭壞死（non-traumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH）主要由血液供應的破壞和凝血纖溶系統紊亂引起，最終導致股骨頭塌陷，為骨科難治性疾病[1]。由于發病較隱匿，缺乏早期臨床癥狀，對其早期檢測尚存困難，因此闡明其病因病機成為當今研究主要方向。中醫藥重視辨析體質狀態，對NONFH的治療有積極作用。本課題組前期研究顯示，血瘀質是NONFH的高發體質類型之一[2]。miRNA是一類非編碼RNA，近年來，越來越多數據表明，其參與破骨細胞的形成、分化、凋亡和吸收[3-4]，在NONFH的發病中扮演了極為重要的角色[5]。基于此，本課題組通過miRNA芯片技術篩選出血瘀質NONFH患者血漿中異常表達的miRNA，并對其進行生物信息學分析，探討血瘀質及相關miRNA異常表達與NONFH發病的相關性，以期為中醫藥調體干預NONFH提供新的思路和依據。

1 資料與方法

1.1 診斷標準

參照《股骨頭壞死臨床診療規范》[6]、《中藥新藥臨床研究指導原則》[7]、《成人股骨頭壞死診療標準專家共識（2012年版）》[8]制定診斷標準。

1.2 中醫體質判定標準

依據《中醫體質分類與判定》[9]制定血瘀體質NONFH相關miRNA組學分析及其靶基因調控網絡研究調查表。按照轉化分對中醫體質類型進行判斷，分為平和質、氣虛質、陽虛質、陰虛質、痰濕質、濕熱質、血瘀質、氣郁質、特稟質共9種類型。平和質：轉化分≥60分，其他8種體質轉化分均小于30分，判斷為“是”；轉化分≥60分，其他8種體質轉化分均小于40分，判斷為“基本是”；不滿足上述條件者判斷為“否”。偏頗體質：轉化分≥40分判斷為“是”，轉化分30～39分判斷為“傾向是”，轉化分＜30分判斷為“否”。

1.3 納入標準

①NONFH組符合上述診斷標準及中醫體質判定標準；②年齡18～70歲；③受試者對本研究知情。

1.4 排除標準

①創傷性股骨頭壞死者；②強直性脊柱炎、骨腫瘤、髖臼發育不良、類風濕關節炎者；③合并嚴重內臟病變或嚴重代謝異常疾病者；④妊娠期婦女；⑤精神疾病或智力障礙者；⑥正在參加其他臨床試驗者。

1.5 一般資料

選擇2016年6月－2017年6月甘肅省中醫院骨科經問卷調查判定為血瘀質NONFH患者及非血瘀質NONFH患者各10例作為NONFH組，選取同期于甘肅省中醫院體檢的健康志愿者8例作為正常組，3組性別（2＝0.223，＝0.890）、年齡（＝0.102，＝0.903）比較差異無統計學意義，具有可比性。本研究經甘肅省中醫院倫理委員會審查批準（2015-018-01）。10例血瘀質NONFH患者為從前期數據庫篩選出的典型單純血瘀體質，經過反復體質判定，不存在偏頗體質。

1.6 病例調查及樣本采集

對調查者進行相關理論知識、調查方法及試驗方法培訓。因NONFH分布不集中，故指定專職調查者進行病例收集。取患者空腹外周血3 mL，置入裝有EDTA抗凝劑的無菌管，混勻，于1 h內室溫下3000 r/min離心10 min，分離血漿，收集上層淡黃色血漿，移至2 mL凍存管內，標記患者信息后置于甘肅省中醫院中心實驗室-80 ℃冰箱保存。

1.7 試驗材料

TRIzol試劑（Ambion公司）、Gene Expression Wash Pack、miRNA complete Labeling and Hyb Kit（24×）、miRNA Spike In Kit、Package 20 backings（8 HD arrays per slide）、Package 20 backings（4 arrays per slide）、Chip（Agilent公司，美國），miScript Ⅱ Reverse Transcription Kit（Qiagen公司，德國），QuantiFast?SYBR?Green PCR Kit（Qiagen公司，德國），Micro Bio-Spin 6（Bio-RAD公司，美國），熒光定量PCR儀（Roche公司，瑞士），引物由Agilent公司提供。

1.8 試驗方法

1.8.1 RNA提取及質量檢測

根據TRIzol試驗步驟進行RNA沉淀、清洗、再溶解、沉淀及抽提，得到總RNA。總RNA采用NanoDrop RND-2000微量紫外分光光度計進行檢測并經Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）檢測RNA完整性。

1.8.2 Agilent microRNA芯片操作及數據分析

RNA質檢合格后，按照流程進行樣本的標記、芯片雜交及洗脫。首先，總RNA經過去磷酸化，變性，再進一步用Cyanine-3-CTP標記。標記好的RNA純化后和芯片雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C（Agilent Technologies）掃描得到原始圖像。采用Feature Extraction（version10.7.1.1，Agilent Technologies）處理原始圖像提取原始數據，利用Genespring（version13.1，Agilent Technologies）進行quantile標準化和后續處理。對標準化后的數據進行過濾，用于比較的每組樣本中至少有1組100%標記為Detected的探針留下進行后續分析。利用檢驗的值和倍數變化值進行差異miRNA篩選，篩選標準為上調或下調倍數變化值≥2.0且≤0.05。

1.8.3 實時熒光定量PCR驗證差異表達miRNA

利用miScript Ⅱ Reverse Transcription Kit將待測RNA反轉錄成cDNA。反轉錄體系：總RNA 0.5 μg，5×miScript HiSpec Buffer 2 μL，10×Nucleics Mix 1 μL，miScript Reverse Transcriptase Mix 0.5 μL，Nuclease-free H2O加至10 μL。反應程序：37 ℃、60 min，95 ℃、5 min。反轉錄完畢后加入90 μL Nuclease-free H2O儲存在-20 ℃冰箱備用。以此cDNA為模板，用QuantiFast?SYBR?Green PCR Kit進行實時熒光定量PCR。反應體系：2×QuantiFast?SYBR?Green PCR Master Mix 5 μL，10 μmol/L Universal primer 0.2 μL，10 μmol/L microRNA-specific primer 0.2 μL，cDNA 1 μL，Nuclease-free H2O 3.6 μL。PCR程序：95 ℃、5 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，40個循環。以2-ΔΔCt值表示miRNA的相對表達水平。重復3次。

1.8.4 差異表達miRNA生物信息學分析

通過TargetScan（http://www.targetscan.org/）、microRNAorg（http://www.microrna.org/microrna/home. do）及PITA（http://www.pita.org.fj/）在線數據庫預測差異表達miRNA的靶基因，TargetScan采用保守miRNA家族的保守位點、PITA采用Scaled Score分值不超過-9.73、microRNAorg采用mirSVR分值不超過-0.1的保守miRNA進行預測。選取3個在線數據庫預測的交集靶基因，進行信號轉導通路（Pathway）富集分析，以判定差異miRNA主要影響的信號通路。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 miRNA差異表達及篩選

與正常組相比，NONFH組有差異表達的miRNA 50個。上調21個，其中hsa-miR-4739、hsa-miR-3610、hsa-miR-134-5p是表達前3位的miRNA，差異倍數（FC）值分別為18.452 68、7.215 677、6.312 345；下調29個，其中hsa-miR-6834-3p、hsa-miR-631、hsa-miR-6892-5p是表達前3位的miRNA，FC值分別為7.900 493、6.327 500、6.299 431。與非血瘀質NONFH組相比，血瘀質NONFH組有差異表達的miRNA 33個。上調10個，其中hsa-miR-6786-5p、hsa-miR-550a-5p、hsa-miR-4788是表達前3位的miRNA，FC值分別為3.598 814、3.477 553、3.325 008；下調23個，其中hsa-let-7b-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-16-5p是表達前3位的miRNA，FC值分別為9.518 297、8.887 547、6.615 946。經篩選，最終確定血瘀質NONFH差異表達miRNA 5個，其中表達上調miRNA為has-miR-4270，表達下調為hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-365a-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-6731-3p，詳見表1。

表1 miRNA差異表達篩選結果

miRNA名稱FC值P值差異表達 has-miR-42705.067 789 0.016 611上調 hsa-miR-129-1-3p5.918 068 9.16E-04下調 hsa-miR-365a-3p6.746 917 0.004 935下調 hsa-miR-483-3p9.078 883 0.013 898下調 hsa-miR-6731-3p7.225 763 0.001 938下調

2.2 實時熒光定量PCR驗證

實時熒光定量PCR結果顯示，與正常組比較，血瘀質NONFH組hsa-miR-365a-3p、hsa-miR-483-3p表達水平明顯下調（＜0.05），與miRNA芯片檢測結果一致。見表2。

表2 實時熒光定量PCR驗證結果（2-ΔΔCt）

組別has-miR-365a-3phas-miR-483-3p 正常組 1.000 0 1.000 0 血瘀質NONFH組 0.230 0* 0.240 0*

注：與正常組比較，*＜0.05

2.3 差異表達miRNA生物信息學分析結果

采用GeneSpring13.1軟件，通過TargetScan、PITA、microRNAorg在線數據庫對差異miRNA進行靶基因預測。結果顯示，hsa-miR-365a-3p檢出交集靶基因11個，余未檢測出交集靶基因，結果見圖1。

圖1 靶基因預測結果

針對差異表達miRNA進行GO分析，共得到111條相關注釋描述，包括分子功能（MF）23條、生物學過程（BP）65條和細胞組分（CC）23條。進一步針對分子功能分析，發現差異表達miRNA主要與受體結合、蛋白與酶的活性有關。見圖2。

Pathway分析顯示，靶基因主要富集于軸突導向、Rap1、賴氨酸降解、Fc epsilon RI、甘油磷脂代謝、T細胞受體、血小板活化、成骨細胞分化等多個信號通路。見表3。

圖2 差異表達miRNA GO分析分子功能結果

表3 差異表達miRNA信號通路及靶基因預測

KEGG IDGeneSymbols hsa04360：Axon guidanceSEMA6D；EFNA3 hsa04015：Rap1 signaling pathwayLCP2；EFNA3 hsa00310：Lysine degradationKMT2D hsa04664：Fc epsilon RI signaling pathwayLCP2 hsa00564：Glycerophospholipid metabolismETNK1 hsa04660：T cell receptor signaling pathwayLCP2 hsa04611：Platelet activationLCP2 hsa04380：Osteoclast differentiationLCP2 hsa04650：Natural killer cell mediated cytotoxicityLCP2 hsa04014：Ras signaling pathwayEFNA3 hsa05206：miRNAs in cancerEFNA3 hsa04151：PI3K-Akt signaling pathwayEFNA3 hsa01100：Metabolic pathwaysETNK1

3 討論

本研究顯示，血瘀質NONFH差異表達miRNA共5個，其中表達上調為has-miR-4270，表達下調為hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-365a-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-6731-3p。隨后對hsa-miR-365a-3p、hsa-miR-483-3p進行實時熒光定量PCR驗證，結果與芯片數據高度一致。研究表明，miR-483可抑制胰島素生長因子1表達[10-12]，促進血管內皮細胞凋亡[13]。研究發現，miR-483與急性心室缺血、血管腔形成及成骨分化有關[14-15]。多項研究表明，miR-365與骨代謝、冠狀動脈粥樣硬化有關[16-18]，這可能是NONFH的發生途徑。

Pathway分析顯示，靶基因主要富集于軸突導向、Rap1、賴氨酸降解、Fc epsilon RI、甘油磷脂代謝、T細胞受體、血小板活化、成骨細胞分化等多個信號通路。其中多條通路參與了骨代謝、脂代謝、血管新生及血小板活化等可能導致NONFH發生的調控。研究表明，Rap1是一氧化氮產生和內皮功能調節的關鍵物質，而一氧化氮系血管穩態的關鍵決定因素[19-20]。Rap1是血小板活化、血管新生和血栓形成關鍵[21]。Ras信號通路被證實與血管內皮細胞增殖及血管形態有關[22-23]。而PI3K/Akt信號通路是細胞內重要的信號通路，是一條從細胞膜到細胞核的快速通路轉導系統，其與細胞凋亡、血管再生密切相關，若受到抑制將導致血管缺血[24]。

綜上所述，本研究采用miRNA芯片技術研究血瘀質NONFH差異表達miRNA，并對這些miRNA進行生物信息學分析。結果表明，血瘀質NONFH差異表達miRNA可能通過調控Rap1、賴氨酸降解、甘油磷脂代謝、血小板活化、成骨細胞分化、Ras、PI3K-Akt等信號通路參與NONFH的發生發展過程。本研究是對NONFH的miRNA基因表達譜的初步探討，僅觀察了NONFH患者及健康志愿者外周血中miRNA的表達情況。今后需擴大樣本進一步針對NONFH高發中醫體質類型探討miRNA與靶基因的關系。

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Screening and Bioinformatics Analysis of Differentially Expressed MicroRNAs in Non-traumatic Osteonecrosis of Femoral Head with Blood Stasis

ZHOU Mingwang1, LI Shenghua1, DENG Chang2, FU Zhibin1, JI Xing1, CHEN Yantong2,HU Xingrong2, LIU Yifei2, WANG Pengzhi2, ZHAO Qiuyue2

To establish the miRNA expression profile and analyze its biological information by screening the miRNA differentially expressed in the peripheral blood of the patients with and without blood stasis and non-traumatic osteonecrosis of femoral head (NONFH); To provide a basis for the prevention and treatment of NONFH with blood stasis.Totally 10 cases of NONFH with out blood stasis (NONFH group), 10 cases of NONFH with blood stasis and 8 cases of healthy volunteers (normal group) were selected. The relative expression of miRNA in plasma was detected by RT-PCR, and the miRNA with different expression was screened. The differential expression of hsa-miR-365a-3p and hsa-miR-483-3p was verified by real-time fluorescence quantitative PCR. Three online databases, TargetScan, microRNAorg, PITA were used to predict the target genes of different miRNAs, and the target genes were analyzed by bioinformatics.Compared with the normal group, 50 miRNAs were differentially expressed, 21 up-regulated and 29 down-regulated in NONFH groups. Compared with the NONFH without blood stasis group, 33 miRNAs were differentially expressed, 10 up-regulated and 23 down-regulated in NONFH with blood stasis group. After screening, five miRNAs with different expression of NONFH with blood stasis group were identified. The results of real-time fluorescent quantitative PCR were consistent with those of miRNA microarray. In the three online databases, 11 cross target genes were screened out; only 11 cross target genes were detected in hsa-miR-365a-3p expression down regulated miRNA; the rest were not detected. GO analysis showed that the differential expression of miRNA was mainly related to receptor binding, protein and enzyme activity. Pathway analysis showed that the differentially expressed miRNA target genes of NONFH with blood stasis were mainly enriched in axon guidance, Rap1, lysine degradation, Fc epsilon RI, glycerophospholipid metabolism, T cell receptor, platelet activation, osteoblast differentiation and other signaling pathways.The different expressions miRNA of NONFH with blood stasis are obtained. These differentially expressed miRNAs may be involved in the development of NONFH by regulating the signal pathways of Rap1, lysine degradation, glycerophospholipid metabolism, platelet activation, osteoblast differentiation, RAS, PI3K-Akt and so on.

blood stasis; non-traumatic osteonecrosis of femoral head; microRNA; gene chip; bioinformatics

R272.968

A

1005-5304(2020)08-0036-05

10.3969/j.issn.1005-5304.201910076

國家自然科學基金（81473712、81560782）

李盛華，E-mail：820512343@qq.com

（2019-10-08）

（2020-01-20；編輯：季巍巍）