應用PCR檢測豬偽狂犬病毒野毒的研究

張婕　李增奎

摘要[目的]對豬偽狂犬病毒野毒進行檢測。[方法]根據(jù)已發(fā)表的豬偽狂犬病病毒gE基因核苷酸序列，設計合成1對引物，擴增片段長度為276 bp，優(yōu)化PCR反應條件，建立檢測PRV野毒的PCR方法。[結果]利用建立的PCR方法檢測疑似PRV野毒感染的臨床送檢組織病料34份，陽性樣品18份，陽性率達52.94 %（18/34），選取6份陽性病料PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列鑒定，測序結果表明均為PRV gE基因特異性序列。[結論]該方法敏感、特異、可靠，可用于PRV野毒感染的快速診斷和流行病學調查。

關鍵詞豬偽狂犬病毒；gE基因；PCR；檢測

中圖分類號S852.65+1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）09-02548-02

作者簡介張婕（1982- ），女，土族，青海大通人，助理獸醫(yī)師，從事畜牧獸醫(yī)研究。

豬偽狂犬病（pseudorabies，PR）是由豬偽狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的豬的一種急性、熱性、敗血性傳染病[1-2]。PRV屬皰疹病毒科（Herpesvifidae）a皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae），具有皰疹病毒的典型特征，可引起豬的潛伏感染[3-4]。PRV的潛伏感染并不使感染豬表現(xiàn)臨床癥狀，但可使感染豬終身帶毒并排毒，增加了PR預防控制的難度，故對PRV潛伏感染豬的篩查至關重要[5]。目前，世界各國廣泛應用PRV gE基因缺失疫苗進行PR的防控，且歐美等發(fā)達國家應用PRV gE基因缺失弱毒疫苗與其配套的鑒別診斷方法已經(jīng)實現(xiàn)了PRV的凈化[6]。我國自20世紀70年代中期以來，廣泛使用gE基因缺失弱毒疫苗，其對PR的防控起到了重要的作用，但同時也給PRV野毒感染和疫苗接種的鑒別診斷帶來了較大困難，尤其是2011年以來我國多個使用gE基因缺失弱毒疫苗免疫的規(guī)模化豬場出現(xiàn)了PRV野毒的感染與流行[7]，亟待建立可以準確診斷PRV強毒和疫苗毒敏感、特異的鑒別檢測方法。鑒于此，筆者根據(jù)PRV gE基因序列設計特異性檢測引物，經(jīng)PCR反應條件的優(yōu)化，建立檢測PRV野毒的PCR方法，實現(xiàn)PRV野毒感染的快速鑒別診斷，以期為PR的綜合防治提供準確、可靠的依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。PRV野毒，由青海省畜牧獸醫(yī)科學院第一實驗室分離鑒定并保存。

1.1.2供試病毒。偽狂犬病病毒活疫苗（Bartha-K61株）和豬傳染性胃腸炎病毒（PEDV）豬流行性腹瀉病毒（TGEV）二聯(lián)活疫苗，均購自哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）弱毒疫苗（CH-1R株）和豬瘟病毒（CSFV）活疫苗（細胞源），均購自普萊柯生物工程股份有限公司產品；疑似PRV野毒感染豬組織病料，由青海省畜牧獸醫(yī)科學院第一實驗室收集并保存。

1.1.3主要試劑。蛋白酶K、Taq酶和dNTP，均購自TaKaRa公司；SDS、苯酚、氯仿和無水乙醇，均為國產分析純，市售。

1.2方法

1.2.1引物設計與合成。參照GenBank上的PRV gE基因序列，應用Primer5.0軟件設計1對引物，擴增產物大小為276 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如下：F1：5′ GAGATGGGCATCGGCGATTAC 3′；R1：5′ GGGCGAGAAGAGCTGCGAGTG 3′。

1.2.2病毒DNA的提取。采用SDS蛋白酶K法提取PRV病毒基因組DNA，取病毒液500 μl，加SDS溶液至終濃度為1%和蛋白酶K至終濃度為200 μg/ml，56 ℃水浴1 h，加入等體積的酚-氯仿混合溶液，離心，取上清加入2倍體積無水乙醇沉淀病毒DNA，用75%乙醇洗滌后，加滅菌水溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3影響PCR反應的幾個重要參數(shù)的優(yōu)化。在保持相同的反應體系和反應條件下，引物F1、R1（20 μmol/L）分別加入0.1、0.5、1.0和1.5 μl；DNA分別加入2、4、6和8 μl；退火溫度分別選擇58、60、62、64和66 ℃；經(jīng)PCR反應條件的優(yōu)化分別確定PCR反應的最佳DNA用量、引物用量、退火溫度。

1.2.4特異性試驗。用優(yōu)化確定的PCR反應條件分別檢測PRV野毒、PRV疫苗毒的DNA以及PEDV、TGEV、PRRSV、CSFV的cDNA，核酸電泳鑒定PCR反應的特異性。

1.2.5靈敏性試驗。將提取的PRV DNA定量，適當稀釋，使其含量分別為1.0、0.1、1.0×10-5、1.0×10-6 和1.0×10-7 μg，用優(yōu)化確定的PCR反應條件分別對其進行檢測，核酸電泳鑒定PCR反應的敏感度。

1.2.6重復性試驗。分別選取PRV野毒、PRV疫苗毒、3份PRV野毒感染陽性病料、3份陰性病料，重復檢測3次，核酸電泳鑒定PCR反應的重復性。

1.2.7初步應用-臨床病料的檢測。利用建立的PCR方法檢測疑似PRV野毒感染的臨床送檢組織病料34份，核酸電泳鑒定檢測方法的臨床適用性。

2結果與分析

3討論

目前，豬偽狂犬病在我國流行廣泛，要想逐步控制和消滅該病，在使用弱毒疫苗免疫的同時，還要逐步排查與及時淘汰野毒感染豬，逐步實現(xiàn)PRV的凈化。近年來，隨著對PRV研究的不斷深入，研究學者已建立了多種鑒別PRV強毒感染與弱毒疫苗的方法，如唐勇等[8]、陽愛國等[9]、白靜等[10]分別建立了鑒別診斷PRV野毒抗體的gELAT、gEELISA、gEGICA血清學方法，這些針對gE抗體的血清學方法雖然能有效區(qū)分野毒感染抗體和疫苗免疫抗體，但病毒感染的早期和潛伏感染期并不產生抗體，故無法做到早發(fā)現(xiàn)、早淘汰。田云等[11]建立了鑒別PRV野毒株的熒光定量PCR檢測方法，但需熒光定量PCR儀等昂貴儀器，且檢測成本較高，操作較復雜，目前只應用于實驗室檢測。有待于尋找一種更廉價的、操作簡單、且能夠檢測出病毒早期感染和潛伏感染，適合基層應用的臨床診斷方法。PCR方法作為簡單、常用的分子生物學診斷技術，具有操作簡單、特異性強、敏感性高和快速高效等優(yōu)點。故研究將PCR技術引入到PRV野毒感染的檢測中，建立了檢測PRV野毒的PCR方法。該方法可有效區(qū)分PRV野毒和疫苗毒，檢測PRV疫苗毒、PEDV、TGEV、PRRSV和CSFV均為陰性，可以檢測到10 pg PRV野毒DNA，具有靈敏、特異、重復性好等優(yōu)點，可望用于臨床上PRV野毒感染的快速檢測，以及PRV野毒和疫苗毒的鑒別診斷，對我國PR的凈化將起到一定的促進作用。

參考文獻

[1] 魏春華，劉建奎，楊小燕，等.豬偽狂犬病病毒的分離鑒定及其gE基因序列分析[J].福建畜牧獸醫(yī)，2012，34（4）：1-3.

[2] MULLEL T，HAHN E C，TOTTEWITZ F，et al.Pseudorabies virus in wild swine：a global perspective[J].Arch Virol，2011，156（10）：1691-1705.

[3] PASDELOUP D，LABETOULLE M，RIXON J F.Differing effects of herpes simplex virus 1 and pseudorabies virus infections on centrosomal function[J].J Virol，2013，87（12）：7102-7112.

[4] 楊睿，翟少欽，王孝友，等.重慶地區(qū)豬偽狂犬野毒株感染的流行病學調查[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013（1）：96-97.

[5] MAHMOUD H Y，SUZUKI K，TSJI T，et al.Pseudorabies virus infection in wild boars in Japan[J].J Vet Med Sci，2011，73（11）：1535-1537.