沒(méi)食子酰芍藥苷通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路減輕PM2.5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷

畢靜 白曉雪 王超

(1湖北省陽(yáng)新縣人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 陽(yáng)新 435200；2吉林大學(xué)第一醫(yī)院干部病房；3淄博市第一醫(yī)院 中醫(yī)科)

PM2.5指環(huán)境空氣中空氣動(dòng)力學(xué)當(dāng)量直徑小于2.5 μm的顆粒物，PM2.5可經(jīng)過(guò)呼吸道進(jìn)入血液中，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病〔1，2〕。沒(méi)食子酰芍藥苷(GPF)是從毛崀科植物芍藥中提取出的有效成分，具有抗氧化作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，GPF可通過(guò)激活核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)/血紅素氧化合酶(HO)-1通路，減輕腦缺血再灌注后氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用〔3〕。本研究旨在探討GPF對(duì)PM2.5導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑 人微血管內(nèi)皮細(xì)胞系 HMEC-1購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；GPF(北京索萊寶科技)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(HyClone)；噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒(美國(guó)Sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD) 試劑盒及丙二醛(MDA)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Nrf2抗體、GAPDH抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、羊抗兔二抗(北京索萊寶科技)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存的HMEC-1細(xì)胞，用10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。傳至第二代，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組與處理 (1)空白對(duì)照組：未添加任何實(shí)驗(yàn)藥物；(2)PM2.5組(終濃度25 μg/cm2)；(3)GPF組：GPF終濃度為100 μmol/L；(4)GPF+PM2.5組：先分別加入終濃度為25、50、100 μmol/L的GPF，預(yù)處理24 h后加入終濃度為25 μg/cm2的PM2.5處理24 h。

1.4MTT測(cè)定 細(xì)胞分組后，在培養(yǎng)板中每孔中加入MTT 10 μl(5 g/L)，37℃孵育4 h，棄去上清液，然后以每孔150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶解細(xì)胞沉淀，酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm每孔的吸光度。

1.5MDA和SOD測(cè)定 將細(xì)胞分組處理，分別收集培養(yǎng)板上的細(xì)胞和上清液，按照MDA和SOD試劑盒說(shuō)明檢測(cè)。

1.6Western印跡檢測(cè)Nrf2的蛋白表達(dá) 將處理后的4組細(xì)胞用常溫磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，于冰上充分裂解30 min，4℃超速離心后提取細(xì)胞上清液，應(yīng)用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定細(xì)胞上清液中蛋白含量，取40 μg每孔上樣，95℃環(huán)境熱浴10 min，采用10%十二烷基硫代硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進(jìn)行蛋白電泳，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，Nrf2(1∶3 000)，GAPDH(1∶10 000)4℃孵育過(guò)夜。次日，Tween-20-Tris(PBST)洗滌后用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，PBST洗滌后，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1GPF對(duì)PM2.5引起的HMEC-1細(xì)胞活性的影響 空白對(duì)照組HMEC-1細(xì)胞多為梭形，邊界清晰，PM2.5誘導(dǎo)細(xì)胞24 h后，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞皺縮，數(shù)量明顯低于空白對(duì)照組。MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，PM2.5呈劑量依賴(lài)式抑制細(xì)胞增殖，PM2.5組與空白對(duì)照組(101.0%±1.5%)相比，細(xì)胞存活率降至(44.1%±4.6%)，因此選擇該濃度造模。當(dāng)GPF組細(xì)胞存活率(47.6%±3.8%)較PM2.5組無(wú)明顯差異，當(dāng)GPF(50，100 μmol/L)預(yù)處理24 h后，與PM2.5組相比較，細(xì)胞存活率分別增加到63.3%±4.1%和82.0%±5.2%，GPF 50、100 μmol/L差異有顯著意義(P<0.01)。

2.2GPF對(duì)PM2.5引起的HMEC-1細(xì)胞中MDA含量和SOD活性的影響 與空白對(duì)照組(103.5%±2.8%)比較，PM2.5組MDA含量(96.8%±3.7%)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，GPF組MDA含量(142.6%±2.7%)明顯增加(P<0.05)，而PM2.5+GPF組MDA含量(127.3%±4.2%)較GPF組顯著降低(P<0.05)；PM2.5組SOD活性(98.5%±4.5%)與空白對(duì)照組(104.3%±2.2%)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而GPF組SOD活性(128.1%±2.8%)空白對(duì)照組明顯下降(P<0.05)，PM2.5+GPF組的SOD活性與空白對(duì)照組比明顯增加(P<0.05)。

2.3GPF對(duì)PM2.5引起的HMEC-1細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組(0.91)相比較，PM2.5組和GPF組Nrf2蛋白水平(0.79、0.83)無(wú)顯著差異；與PM2.5組相比，PM2.5+GPF組Nrf2蛋白表達(dá)(1.32)明顯升高(P<0.05)，這表明GPF可以活化PM2.5損傷細(xì)胞的Nrf2，而對(duì)正常細(xì)胞Nrf2的活化無(wú)明顯影響，如圖1。

圖1 4組HMEC-1細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)

3 討 論

PM2.5顆粒對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有一定的毒性作用〔4，5〕，易感染或引起其他心血管疾病。Wan等〔6〕通過(guò)發(fā)現(xiàn)小鼠AS斑塊的形成，證實(shí)了PM2.5對(duì)心血管的生理毒性，同時(shí)也揭示了我國(guó)大氣污染面臨著嚴(yán)峻的發(fā)展形勢(shì)。

文獻(xiàn)報(bào)道，抗氧化性的植物可抑制心血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷〔7，8〕，GPF具有抗氧化作用。Nrf2是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子，在抗炎、抗氧化、抗腫瘤等方面發(fā)揮著重要的作用，是細(xì)胞防御應(yīng)激損傷的關(guān)鍵因子〔9〕。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)GPF可以通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路，對(duì)PM2.5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞起保護(hù)和抑制作用。