焦磷酸測序技術對腸促胰素作用相關基因的SNP位點分型

施愛明 錢晨月 趙奉倫 蘇存錦 潘杰

(蘇州大學附屬第二醫院，江蘇 蘇州 215004)

胰島素的分泌受餐后血糖水平升高的刺激，也受腸促胰素效應的調控，在健康者中，腸促胰素效應負責大約70%的餐后胰島素分泌，對正常機體的血糖調節過程起著重要作用。然而生理性腸促胰素在分泌后1～2 min內即被二肽基肽酶(DPP)-4降解失活，DPP-4 抑制劑通過抑制DPP-4 對活性腸促胰素的水解作用，增加活性腸促胰素的水平而改善血糖控制，是治療2型糖尿病(T2DM)的新靶點〔1，2〕。臨床使用過程中發現，DPP-4抑制劑的療效存在個體差異，決定DPP-4抑制劑治療反應的因素目前尚未完全闡明，個體遺傳基因差異可能是影響DPP-4抑制劑療效反應原因之一。研究發現，T2DM患者普遍存在腸促胰素效應減弱，可能原因包括腸促胰素分泌減少、DPP-4降解腸促胰素活性升高及腸促胰素受體信號轉導通路受損等；因此參與腸促胰素合成、降解和作用通路的相關基因的遺傳變異成為研究 DPP-4抑制劑療效差異的靶點〔3～7〕。

本研究擬對編碼胰高血糖素樣肽受體(GLPIR)基因的rs3765467位點和抑胃肽受體(GIPR)基因的rs10423928位點、腸促胰素合成通路中TCF7L2基因的rs7903146位點、影響DPP-4酶活性的rs4664443和rs12617656位點，采用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增聯合焦磷酸測序技術建立單核苷酸多態性(SNPs)的檢測方法，并驗證其準確性和可行性，為研究腸促胰素作用相關基因的SNP與DPP-4抑制劑療效的相關性奠定基礎。

1 對象與方法

1.1對象 選擇2018年1～6月蘇州大學附屬第二醫院就診的口服DPP-4抑制劑的T2DM患者35例，其中男27例，女8例，平均年齡為(55.6±14.7)歲。

1.2儀器與試劑 凝膠成像系統和水平電泳槽(上海Bio-Rad公司)；PCR擴增引物和焦磷酸測序引物合成(上海生工生物有限公司)；血液基因組DNA提取試劑盒(美國Magen公司)；PCR擴增試劑盒(日本Takara公司)；美國ABI Veriti96 PCR儀(美國ABI生物系統公司)；PyroMark Q24焦磷酸測序儀和焦磷酸測序試劑盒(德國Qiagen公司)。

1.3基因組 DNA的提取采用DNA提取試劑盒進行35例T2DM患者的全血DNA提取，并進行質量檢測和純度鑒定，確保每份DNA濃度大于30 μg/μl，提取后DNA樣本置于-20℃保存備用。

1.4引物設計 在美國國家生物技術信息中心(NCBI)上分別下載rs3765467、rs10423928、rs7903146、rs4664443及rs12617656這5個SNP位點所在的基因序列，采用PyroMark Assay Design Software2.0(德國Qiagen公司)設計PCR引物和測序引物。5個SNP位點引物見表1。

表1 rs7903146，rs12617656，rs4664443，rs3765467和rs10423928引物序列

1.5PCR擴增 PCR總反應體積為50 μl，包括：Ex Taq HS 0.25 μl，10×Ex Taq緩沖液5 μl，dNTPmix 4 μl，上下游 PCR引物各1 μl，基因組DNA 5 μl，RNase-free water 33.75 μl。PCR條件：98℃ 15 min，98 10 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，共循環35個周期，循環結束后72℃10 min。所有PCR產物應用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行進一步的分析和鑒定。

1.6焦磷酸測序分型檢測 取8連管，每管加入80 μl反應體系，包括磁珠1 μl，結合緩沖液40 μl，PCR產物15 μl，高純水24 μl。1 400 r/min室溫振蕩10 min。打開真空泵，將真空預備工具在高純水中清洗30 s，移到8連管的孔中抽吸樣品，捕獲帶有PCR 產物的親和素包被的磁珠。依次用70%乙醇、變性緩沖液、清洗緩沖液沖洗10 s，關閉真空開關，將真空預備工具置入預加有0.4 μmol/L 測序引物(10 μmol/L測序引物1 μl和退火緩沖液24 μl)的焦磷酸測序(PSQ)24孔板中，輕輕晃動，釋放親和素包被的磁珠。將PSQ 24孔板置于預熱好的板架上，80℃加熱2 min、室溫平衡2 min后，置于焦磷酸測序儀內進行測序。通過PyroMark Q24 軟件對結果進行分析。

1.7Sanger測序驗證 將這35例臨床樣本提取的DNA送蘇州金唯智生物有限公司采用 Sanger測序法檢測，進行SNP的二輪驗證，保證上述所建焦磷酸分型檢測方法的準確性。

2 結 果

2.1PCR結果 凝膠電泳結果顯示，5個SNP位點的PCR產物均在相應位置呈單一條帶，見圖1，擴增特異性好。

M：Marker,1.患者1，2.患者2圖1 2例患者5個SNP位點PCR產物凝膠電泳結果

2.2焦磷酸測序與Sanger測序結果 對35例患者5個SNP位點的基因多態性進行了焦磷酸測序，檢測信噪比高，非特異峰的比例均在 10%以內，多態位點基因型可清晰判斷，檢測成功率100%。為了驗證方法的準確性，同時采用Sanger測序技術對上述患者的 5個 SNP位點進行測序，測序結果見圖2～6，分型結果見表2。兩種方法的基因分型結果完全一致，35例患者5個SNP位點的突變比例與已報道的文獻結果相接近〔5，8-10〕。

A.焦磷酸反向測序；B.Sanger反向測序，下圖同圖2 rs3765467多態性典型測序

圖3 rs10423928多態性典型測序

圖4 rs7903146多態性典型測序

圖5 rs4664443多態性典型測序

圖6 rs12617656多態性典型測序

表2 35例患者SNP位點基因型焦磷酸測序結果〔n(%)〕

3 討 論

經過引物設計篩選和對PCR的退火和循環等擴增條件優化，最終5個SNP位點可以在相同的條件下進行擴增，非特異性擴增產物少，PCR擴增特異性好。焦磷酸測序是一種基于DNA序列的酶聯級聯測序技術，被廣泛應用于基因多態性檢測、甲基化檢測及微生物鑒定等領域〔11～14〕，本文所建焦磷酸測序方法檢測信噪比高，非特異峰低，多態位點基因型可清晰判斷，檢測成功率100%。

文獻報道韓國人GLPIR基因rs3765467位點突變純合型比率僅為2.8%〔5〕，本文檢測到突變純合型比率與文獻報道的中國人群突變純合型比率(15.3%)相近〔8〕。Meta分析結果顯示GIPR基因rs10423928位點攜A堿基突變與患者糖代謝異常相關〔6〕，本研究與NCBI中dbSNP公共數據庫報道的頻率一致。TCF7L2基因rs7903146位點為近期研究熱點，許多研究顯示rs7903146位點與多種疾病發生存在相關性，Meta分析結果顯示rs7903146位點的多態性與進展為T2DM風險相關〔15〕。本文結果未檢測到純合型突變，與李云〔9〕報道的200例福建籍漢族人群檢測結果一致，說明此位點在中國人群發生突變的比例較低。DPP-4基因rs12617656位點野生型、雜合型和突變純合型比例與文獻報道一致〔5〕。DPP-4基因rs4664443位點野生型、雜合型和突變純合型比例與邢曉敏〔10〕報道的中國人群的結果一致。