miR-136調控FDZ4通過WNT信號通路抑制非小細胞肺癌的增殖和誘導凋亡

謝五菊 王成存 吳文漢

(海南西部中心醫院呼吸內科，海南 儋州 571700)

非小細胞肺癌是肺癌的主要病理分型，其具有惡性程度高及遠處轉移等特點，但關于非小細胞肺癌的靶向治療仍為目前臨床治療難點〔1〕。研究表明，非小細胞肺癌早期檢測方法的缺乏是導致患者生存率降低的主要原因〔2〕。因此深入研究非小細胞肺癌發生及發展的過程對早期診斷及治療方案的制定均具有重要意義。研究表明，微小RNA-136(miR-136)在非小細胞肺癌中呈低表達，過表達miR-136可抑制肺癌細胞增殖及遷移〔3，4〕。相關研究報道指出，miR-136可通過靶向星形膠質細胞上調基因(aEg)1和Bcl-2進而誘導胃癌細胞凋亡〔5〕。但miR-136對非小細胞肺癌細胞增殖及凋亡的研究未見報道。通過生物學信息手段檢測miR-136的靶基因發現FZD4可能是miR-136的靶基因，研究表明FZD4在非小細胞肺癌組織中上調表達，并可通過Wnt/β-連環蛋白(catenin)信號通路調控肺癌細胞遷移和侵襲及EMT的發生〔6，7〕。然而，有關miR-136與FZD4在非小細胞肺癌中的研究相對較少，本研究旨在探討miR-136在非小細胞肺癌細胞增殖及凋亡過程中的作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人正常肺上皮細胞株BEAS-2B與人肺癌細胞株H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。Lipofectamine2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；miR-136 mimic、miR-con均購自美國Ambion公司；胎牛血清與RPMI1640培養基均購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技公司；FDZ4抗體與β-actin抗體均購自美國Epigentek公司；Trizol試劑購自美國Ambion公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自美國Kapa公司；RNA反轉錄試劑盒購自美國GeneCopoeia公司；熒光素酶報告載體與熒光素酶活性檢測試劑盒均購自美國Promega公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)購自美國Amresco公司；細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4抗體購自美國CST公司；細胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-9、Bax、Bcl-2抗體均購自美國Epitomics公司；兔抗糖原合成酶激酶(GSK)-3β、β-catenin、c-Myc抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；核蛋白提取試劑盒購自美國ThermoFisher公司。

1.2細胞培養、轉染及分組 人正常肺上皮細胞株BEAS-2B與人肺癌細胞株H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446放入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，置于37℃恒溫培養箱進行培養，待細胞生長融合度達到70%左右時進行傳代培養。收集對數生長期SPC-A-1細胞，用胰蛋白酶消化細胞后調整細胞濃度為5×104個細胞/ml，以每孔2 ml體積的細胞接種于6孔板，置于37℃恒溫培養箱培養至細胞融合度達50%左右時進行轉染，轉染時分別將miR-136 mimic、miR-con、anti-miR-NC、anti-miR-136轉染于SPC-A-1細胞中，為明確miR-136與FDZ4的調控作用及其對SPC-A-1細胞增殖及凋亡的影響，將miR-136 mimic分別與pcDNA-FDZ4、pcDNA共轉染于SPC-A-1細胞，分別為miR-136+pcDNA-FDZ4組、miR-136+pcDNA組。轉染步驟：①根據Lipofectamine2000試劑盒說明書配置Lipofectamine2000與轉染質粒的復合體混合液；②不含血清培養液洗滌待轉染細胞并加入1 ml不含胎牛血清的RPMI1640培養基；③復合體混合液加入6孔板；④轉染6 h后更換含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，放入恒溫培養箱繼續培養48 h收集細胞。

1.3qRT-PCR檢測細胞中miR-136、FDZ4 mRNA表達水平 分別收集BEAS-2B、H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446與轉染后各組SPC-A-1細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，qRT-PCR擴增反應：配置反應體系與實時熒光定量PCR儀檢測。反應體系為20 μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各0.6 μl，滅菌ddH2O 6.8 μl。PCR儀擴增程序：95℃ 3 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40次循環。miR-136以U6為內參，FDZ4 以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算不同細胞中檢測miR-136、FDZ4 mRNA的相對表達量。

1.4Western印跡檢測FDZ4、CDK4、CyclinD1、Caspase-9、Bax、Bcl-2及WNT信號通路相關蛋白表達 分別收集各組細胞分別加入蛋白裂解液( 1 ml RIPA、1% PMSF、0.1% 抑肽酶)提取細胞總蛋白，另收集miR-136+pcDNA組、miR-136+pcDNA-FDZ4組SPC-A-1細胞加入核蛋白提取試劑提取細胞核總蛋白以檢測細胞核內β-catenin蛋白表達，其余蛋白表達檢測均選用細胞總蛋白。分別檢測蛋白濃度后取等量蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)反應分離蛋白，將蛋白凝膠移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入一抗，4℃孵育24 h，TBST洗滌3次×10 min，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次×10 min，滴加ECL發光劑，凝膠成像分析儀檢測各蛋白條帶并用Image圖像分析軟件分析條帶灰度值。

1.5MTT法檢測細胞增殖 分別收集各組細胞，胰蛋白酶消化細胞后以每孔5×103個細胞接種至96孔板，每個樣本均設置6個復孔，置于培養箱中培養24、48、72、96 h時在每孔加入20 μl MTT試劑，培養4 h后每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min后選擇波長為490 nm在酶標儀上檢測各孔光密度(OD)值。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組SPC-A-1細胞，待細胞融合度達80%左右時用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，1 000 r/min離心10 min，取1×106個細胞加入結合緩沖液懸浮細胞(100 μl)，依次加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，混勻后避光孵育10 min，流式細胞儀檢測各組SPC-A-1細胞凋亡率。

1.7雙熒光素酶報告基因實驗 用生物學信息學方法預測miR-136的潛在靶標，FDZ4 3′UTR與miR-136存在結合位點，將含有FDZ4 3′UTR野生序列片段(WT-FDZ4)與FDZ4 3′UTR突變序列(MUT-FDZ4)分別插入熒光素酶報告基因載體，轉染前1 d收集SPC-A-1細胞，以每孔5×105個細胞的密度接種至24孔板，將WT-FDZ4、MUT-FDZ4分別與miR-136 mimic或陰性對照共轉染至SPC-A-1細胞，轉染48 h后根據雙熒光素酶活性檢測試劑盒測定細胞相對熒光素酶活性。

1.8統計學處理 采用SPSS19.0統計學軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-136和FDZ4在人肺癌細胞和人正常肺上皮細胞中的表達 qRT-PCR結果顯示，與BEAS-2B細胞比較，miR-136在H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446細胞中的表達均明顯下調(P<0.05)，其中以SPC-A-1細胞下調最為明顯，而FDZ4 mRNA及蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)，其中以SPC-A-1細胞上調最為明顯，見圖1、表1。本研究選取SPC-A-1細胞進行后續實驗。

表1 miR-136和FDZ4在人正常肺上皮細胞株BEAS-2B和人肺癌細胞株H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446中的表達

圖1 檢測FDZ4蛋白表達

2.2上調 miR-136表達對人肺癌細胞株SPC-A-1增殖的影響 qRT-PCR結果顯示，與miR-con組比較，miR-136組SPC-A-1細胞中miR-136表達水平明顯上調(P<0.05)，而NC組差異無統計學意義(P>0.05)。MTT結果顯示，miR-136組SPC-A-1細胞增殖能力在48、72、96 h后明顯受到抑制，與miR-con組比較差異均有統計學意義(均P<0.05)。Western印跡結果顯示，miR-136組CDK4、CyclinD1蛋白表達水平較miR-con組明顯降低(P<0.05)，見圖2、表2。

圖2 檢測人肺癌細胞株SPC-A-1增殖相關蛋白CDK4和Cyclin D1表達

表2 上調miR-136表達對結腸癌細胞增殖的影響

2.3上調miR-136表達對人肺癌細胞株SPC-A-1凋亡的影響 miR-136組SPC-A-1細胞凋亡率顯著高于miR-con組、NC組(P<0.05)。Western印跡結果顯示，相較于miR-con組，miR-136組SPC-A-1細胞中Caspase-9、Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)，見圖3，圖4，表3。

圖3 人肺癌細胞株SPC-A-1凋亡率

圖4 Western印跡檢測細胞凋亡蛋白表達

表3 上調miR-136表達對人肺癌細胞株SPC-A-1凋亡的影響

2.4miR-136靶向調控FDZ4蛋白表達 FDZ4與miR-136存在結合靶點，見圖5。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，轉染miR-136 mimic可顯著降低WT-FDZ4的熒光素酶活性(P<0.05)，而不能抑制MUT-FDZ4的熒光素酶活性(P>0.05)，見表4。Western印跡結果顯示，miR-136組FDZ4蛋白表達(0.28±0.04)顯著低于miR-con組(0.67±0.06，P<0.05)，anti-miR-136組(0.88±0.09)顯著高于anti-miR-con組(0.62±0.07，P<0.05)，見圖6。

圖5 FDZ4的3′UTR中含有與miR-136互補的核苷酸序列

圖6 Western印跡檢測miR-136對FDZ4蛋白表達的影響

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5FDZ4過表達逆轉了上調miR-136抑制人肺癌細胞株SPC-A-1增殖和誘導凋亡的作用 MTT結果顯示，與miR-136+pcDNA組比較，miR-136+pcDNA-FDZ4組SPC-A-1細胞增殖活性在48、72、96 h明顯增強(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果顯示，miR-136+pcDNA-FDZ4組SPC-A-1細胞凋亡率明顯低于miR-136+pcDNA組(P<0.05)，Western印跡檢測結果顯示，共轉染miR-136 mimic與pcDNA-FDZ4后SPC-A-1細胞中CyclinD1蛋白表達明顯上調(P<0.05)，而Caspase-9蛋白表達明顯下調(P<0.05)，見表5、圖7。

表5 FDZ4過表達逆轉了上調miR-136抑制人肺癌細胞株SPC-A-1增殖和誘導凋亡的作用

圖7 人肺癌細胞株SPC-A-1中FDZ4、CyclinD1和Caspase-9蛋白表達

2.6miR-136和FDZ4的表達對人肺癌細胞株SPC-A-1中WNT信號通路的影響 Western印跡結果顯示，SPC-A-1細胞轉染miR-136 mimic后GSK-3β蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，而β-catenin、c-Myc蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，共轉染miR-136 mimic與pcDNA-FDZ4后SPC-A-1細胞中GSK-3β蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，而β-catenin、c-Myc蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)，見表6、圖8。

圖8 檢測人肺癌細胞株SPC-A-1中β-catenin、GSK-3β和c-Myc蛋白表達

表6 FDZ4過表達逆轉了上調miR-136對人肺癌細胞株SPC-A-1WNT信號通路的作用

3 討 論

非小細胞肺癌是常見的惡性腫瘤之一，由于早期患者臨床癥狀隱匿導致確診時已處于中晚期，目前采用手術治療晚期患者，但治療效果不佳且患者預后較差〔8〕。因而關于非小細胞肺癌新型生物標志物機制新型治療靶點的探究成為熱點。研究表明miRNA可調控細胞生長發育及增殖、遷移等生物學過程〔9〕。相關研究發現miR-106可通過調節靶基因表達進而影響非小細胞肺癌細胞增殖及凋亡過程〔10〕。但關于miRNA與非小細胞肺癌發生及發展的研究仍相對較少，因此積極尋找新型miRNA有助于臨床早期診斷及治療。

miR-136在乳腺癌、肺鱗癌等多種惡性腫瘤中均呈低表達，并可通過調控下游靶基因表達進而參與腫瘤發生及發展過程〔11,12〕。Guo等〔13〕研究表明，miR-136可通過調節metadherin表達進而抑制骨肉瘤發生及發展。miR-136還可通過靶向環氧合酶2進而抑制肝細胞癌細胞的惡性進展〔14〕。研究表明抗癌藥物的研究多以調控細胞周期相關因子為治療靶點，Cyclin D1作為細胞周期的啟動因子可與CDK4結合進而促進細胞周期由G1期轉化為S期從而促進細胞增殖〔15，16〕。提示miR-136過表達后主要通過下調CDK4、Cyclin D1水平影響細胞周期轉變為S期而誘導細胞周期停滯于G1期進而抑制非小細胞肺癌細胞增殖。本研究結果表明SPC-A-1細胞中上調miR-136表達可增加細胞凋亡率。研究表明，通過抑制Caspase-9、Bax表達及促進Bcl-2表達可有效促進細胞凋亡〔17〕。提示miR-136可通過影響細胞增殖及凋亡蛋白表達進而參與非小細胞肺癌發生及發展過程。

FDZ4在膠質瘤細胞中呈高表達并可促進膠質瘤細胞增殖及侵襲〔18〕。研究報道，FDZ4可作為癌基因并通過調控WNT信號通路進而促進前列腺癌細胞發生上皮-間質轉化〔19〕。本研究結果顯示不同非小細胞肺癌細胞中FDZ4表達水平均顯著升高，雙熒光素酶報告基因實驗結果發現FDZ4是miR-136的靶基因，本研究結果提示miR-136可靶向抑制FDZ4表達并通過影響細胞增殖及凋亡蛋白表達進而促進非小細胞肺癌凋亡并減弱細胞增殖能力。WNT信號通路異常激活可促進肺癌細胞增殖并抑制細胞凋亡，如何抑制WNT信號通路激活進程成為非小細胞肺癌治療的重要輔助治療手段〔20，21〕。GSK-3β是WNT信號通路的負性調控因子，而β-catenin是WNT信號通路的正性調控因子，研究表明GSK-3β可通過與β-catenin結合進而促使其降解導致細胞內β-catenin水平降低，若WNT信號通路異常激活導致GSK-3β水平降低，細胞質內β-catenin未被及時降解導致其進入細胞核，促進下游c-Myc等靶基因表達進而促進腫瘤發生及發展〔22，23〕。本研究結果表明上調miR-136可抑制WNT信號通路活化，但上調FDZ4表達可激活WNT信號通路。提示miR-136可靶向調節FDZ4表達并通過抑制WNT信號通路而影響細胞增殖相關因子表達進而參與非小細胞肺癌發生及發展過程。

綜上，miR-136在非小細胞肺癌細胞中表達下調，而FDZ4表達上調，miR-136可通過下調FDZ4抑制非小細胞肺癌細胞增殖并誘導細胞凋亡，其可能通過抑制WNT信號通路而發揮作用，可為非小細胞肺癌靶向治療提供理論依據。