安神補腦液對失眠大鼠模型海馬組織內GABA_ARα1、GABA_ARγ2、NKCC1表達的影響

于智莘 呂宏亮 李晶 宋琳琳 粟栗 于江波

(1長春中醫藥大學，吉林 長春 130117；2吉林敖東延邊藥業股份有限公司)

失眠又稱入睡和維持睡眠障礙(DLMS)，臨床上以難于入睡、頻度過短、深度不足、早醒及睡眠質量不佳、持續時間短等為主要癥狀的一種病證〔1〕。臨床上用于治療失眠的藥物主要以人工合成的鎮靜催眠的西藥制劑為主，通過縮短睡眠潛伏期，延長睡眠時間起到改善睡眠質量的作用，但因其對大腦中樞神經系統(CNS)存在廣泛的抑制作用，長期服用極易產生成癮性和依賴性。中醫藥在治療失眠方面療效顯著，無成癮性、依賴性，無不良反應及停藥反跳現象，且藥毒性及副作用少。安神補腦液(ASBN)具有安神健腦、生補精髓、涵養氣血之功效。本文通過建立失眠動物模型，觀察ASBN對失眠大鼠睡眠狀態的改善作用及該藥對模型大鼠海馬體內γ-氨基丁酸受體(GABA)_ARα1、GABA、ARγ2、Na+-K+-Cl-協同轉運蛋白(NKCC1)表達的影響，從而從海馬體內神經遞質受體及NKCC1表達的角度探索ASBN治療失眠的機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物及材料 SD大鼠90只購自遼寧省長生生物技術股份有限公司，動物合格證號：SCXK-(遼)2015-0001，9～11周齡，體重185～215 g，雄雌各半。KM昆明種小鼠20只購自遼寧省長生生物技術股份有限公司，動物合格證號：SCXK-(遼)2015-0001，10～12周齡，體重18～22 g，雄雌各半。

試劑：對氯苯丙氨酸(PCPA)(Sigma，USA)；合成PCR引物(Sangon Biotech上海)；戊巴比妥鈉(Sigma，USA)； UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒(Sangon Biotech，上海)；兔抗GABA_ARα1 (Protein Tech，USA) ，兔抗GABA_ARγ2(Protein Tech，USA) ，NKCC1(Protein Tech，USA) ； Trans Script Green Two-Stepq RT-PCRSuperMix(全式金生物技術，北京)；北京化工廠氯仿(CNNo.32061)；生理鹽水(四藥有限公司，石家莊，批號:H2015653)；MS104TS 電子天平(梅特勒-托利公司，瑞士)； 7500型Real-timePCR儀(ABI)。

1.2復制失眠模型〔2〕SD大鼠先進行適應性喂養7 d后進行稱重，運用完全隨機分組法分為正常組(15只)和模型組(75只)，模型組腹腔注射PCPA混懸液，正常組腹腔注射等體積0.9%生理鹽水，連續注射2 d后觀察模型組及正常組狀態。將復制成功的失眠模型大鼠完全隨機分為模型組、ASBN-高劑量(H)組、ASBN-中劑量(M)組、ASBN-低劑量(L)組和氟西汀(Fluoxetine)組各15只。正常組和模型組連續7 d生理鹽水灌胃；Fluoxetine組：連續7 d Fluoxetine 1.5 mg/kg灌胃；ASBN-H組、ASBN-M組、ASBN-L組：連7 d ASBN 100、75、50 mg/kg灌胃。根據大鼠給藥體表面積公式計算出各用藥組大鼠的給藥劑量。

1.3探索戊巴比妥鈉睡眠劑量的閾值〔3～6〕該實驗首先通過入睡率確定戊巴比妥鈉睡眠劑量的閾值。入睡的評定標準：給藥30 min內小鼠翻正反射消失>1 min。戊巴比妥鈉睡眠劑量閾上值評定標準：小鼠完全入睡，又不使睡眠時間過長的劑量；戊巴比妥鈉睡眠劑量閾下值評定標準：90%～100%小鼠翻正反射不消失的藥物最大劑量。經過預實驗確定，小鼠戊巴比妥鈉睡眠劑量閾值為35～45 mg/kg。

測試前小鼠禁食12 h，稱取體重，計算每只小鼠注射戊巴比妥鈉的劑量。6組小鼠于第5天給藥30 min后，經腹腔注射戊巴比妥鈉閾下值35 mg/kg，以小鼠翻正反射消失時間為指標，記錄30 min內入睡小鼠百分率為入睡率。

1.4觀察指標 觀察大鼠精神，活動狀態，皮毛顏色，飲水、進食量及對外界刺激的反應等。

1.5對戊巴比妥鈉閾下值大鼠入睡率的影響〔7～9〕ASBN-H、M、L組灌胃，模型組給予等劑量0.9%生理鹽水，灌胃結束后1 h，各組動物腹腔注射戊巴比妥鈉閾下值35 mg/kg(臨用前現配)，Fluoxetine組給予0.25 mg/kg Fluoxetine溶液，灌胃量0.01 ml/g。觀察并記錄給予戊巴比妥鈉后30 min內各組大鼠入睡的數量(入睡評定標準：30 min內翻正反射消失達1 min以上)。

1.6免疫組化染色(IHC)-P法檢測大鼠海馬體齒狀回GABA_ARα1的表達〔10，11〕取材：最后一次給藥1 h后，每組隨機取大鼠10只，雄雌各半，腹腔注射10%水合三氯乙醛〔CCl3CH(OH)2〕3 ml/kg進行麻醉，腹主動脈采血，10 min后，灌注大量生理鹽水沖洗至肝臟發白，流出液基本無色后灌注4%多聚甲醛，致全身僵硬，于10 min后斷頭取腦，放入4%多聚甲醛溶液中，置于4℃固定，取海馬段，常規石蠟包埋切片。IHC：60℃烤片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度入水，沖洗，抗原修復，內源性過氧化物歧化酶封閉，加一抗1∶50工作液，2～8℃孵育過夜，生物素標記(兔抗GABA_Aα1)，室溫孵育，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，加辣根過氧化物酶(HRP)標記的霉親和素室溫孵育，PBS 沖洗，DAB顯色，沖洗，蘇木素復染，鹽酸-乙醇分化，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下檢測。GABA_ARα1受體蛋白OD值檢測：使用Image Pro plus(IPP)7.0圖像分析軟件，檢測陽性細胞的積分OD值，每張切片選取5個視野，取平均值。

1.7qPCR〔6〕加入Trizol研磨大鼠海馬體腦組織，取上清液，依次加入CCl3、C2H5OH提取總RNA；根據總RNA濃度計算模板加樣量，使用RT-PCR試劑盒逆轉錄成cDNA，GABA_ARγ2正義鏈：5′-CTTCTTCGGATGTTTTCCTTCAGG-3′，反義鏈：5′-CATAGGGTATTAGATCGTTGGACT-3′，退火溫度60℃，NKCC1正義鏈：5′-TTACTACCTGCGCACCTTCG-3′，反義鏈：5′-TCCAGCTCATCGTGGAACTC-3′，退火溫度62℃，β-actin上游引物：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物：5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，退火溫度61℃。PCR擴增反應條件：95℃ 10 min,95℃ 20 s,60℃ 60 s,擴增36～40個循環。反應結束后，讀取PCR軟件內的循環閾值(CT值)，采用ΔΔCT法處理結果，以β-actin為內參計算GABA_ARγ2和NKCC1的相對表達量，以2-ΔΔCt表示。

1.8統計學分析 采用SPSS22.1軟件行方差分析。

2 結 果

2.1一般狀態 正常組精神狀態良好，活動敏捷，毛發光亮，體重明顯增加。模型組精神亢奮，易激惹，毛發干枯、無光亮，飲水量明顯增加，形體消瘦。Fluoxetine組和ASBN-H、M、L組精神狀態、活動情況均不同程度優于模型組。

2.2戊巴比妥鈉閾下值催眠實驗 正常組入睡率為25%，與模型組(10%)比較，各劑量給藥組均能使戊巴比妥鈉閾下值30 min內的入睡率增加(Fluoxetine組90%，ASBN-H、M、L組為74%、52%、40%；P<0.05)。

2.3ASBN對失眠大鼠模型海馬體組織中GABA_ARα1受體表達量的影響 在光學顯微鏡下可見，免疫組織化學切片的背景呈現淡黃色，免疫陽性細胞呈現不同程度的棕黃色，海馬體齒狀回GABA_ARα1受體呈現圓形、卵圓形及多角形，大小不一，細胞突起為 2～3個。結果顯示，模型組(0.030 2±0.009 6)與正常組(0.053 6±0.024 9)比較，大鼠海馬體齒狀回GABA_ARα1受體表達量明顯減少(P<0.05)。與模型組比較，Fluoxetine組(0.052 1±0.030 7)顯著增加(P<0.01)，ASBN-H組(0.049 2±0.036 8)明顯增加(P<0.05)；ASBN-M組(0.047 7±0.029 6)、ASBN-L組(0.044 9±0.030 2)與模型組差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 各組海馬體齒狀回GABA_ARα1表達(IHC-P,×100)

2.4GABA_ARγ2和NKCC1 mRNA在失眠大鼠海馬體腦組織中的表達 各組GABA_ARγ2 mRNA表達差異顯著(P<0.05)；模型組較正常組明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，Fluoxetine組、ASBN-H組明顯增高(P<0.05)。各組NKCC1 mRNA表達無明顯差異(P>0.05)，但模型組表達呈升高趨勢，且各用藥劑量組都呈現降低趨勢，見表1。

表1 各組海馬體GABA_ARγ2、NKCC1 mRNA 表達比較

3 討 論

睡眠是人體最基本的生理功能，既重要又復雜，涉及中樞系統的多個部位，且受到多種因子的影響。目前已知的部位涉及腦干、下丘腦、皮質、海馬區等多個腦區，涉及的因子主要有神經遞質、激素、細胞因子、肽類物質等。經過長期研究表明，海馬與人體睡眠關系密切。其中海馬體〔9〕內GABA_ARα1、GABA_RA、γ2、NKCC1可作為研究失眠機制的重要依據。GABA_AR藥理學研究集中在BDZ位點上，通過結合GABA_AR上一個特異的識別位點(α1)，進而增加Cl-通道的開放頻次，使Cl-內流，細胞膜超極化，產生具有抑制性的突觸后電位，從而增強對GABA的抑制作用。本實驗以此作為選取GABA_ARα1、GABA_AR、γ2作為觀察指標的理論支撐〔10〕。

本研究結果表明，ASBN對改善失眠大鼠睡眠節律有一定作用，其作用機制可能是提高大鼠海馬體中GABA_ARα1和 GABA_ARγ2，減少NKCC1，從而起到治療作用。