溫陽振衰顆粒對慢性心力衰竭模型大鼠心肌LncRNA BIC/miR-155調控P38MAPK表達的影響

徐則林 陳新宇 陳青揚 吳治諺 蔡虎志

(1湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2江門五邑中醫院)

慢性心力衰竭(CHF)由冠心病、高血壓、心臟瓣膜病、擴心病等各類原發心臟疾病發展至后期所致，臨床以體液潴留為主要體征，以胸悶乏力、呼吸困難、活動受限為主要表現〔1～3〕。課題組長年從事CHF的中醫藥防治工作，前期研究證實絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)四大亞型中與炎性刺激密切相關的P38MAPK亞型與CHF的發展密切相關，且P38MAPK的蛋白磷酸化程度隨著CHF的進展也顯著上調，溫陽振衰顆粒可以抑制P38MAPK蛋白磷酸化的過度表達〔4〕。作為P38MAPK的上游非編碼基因，LncRNA BIC/miR-155能通過MAPK激酶(MKK)-3及MKK-6通路直接調控P38MAPK mRNA的表達〔5,6〕。本研究擬進一步闡釋溫陽振衰顆粒是否通過LncRNA BIC/miR-155調控P38MAPK進而對CHF產生治療作用。

1 材料與方法

1.1動物 40只SD健康SPF級實驗大鼠由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供〔SCXK(湘)2014-002〕，所有實驗大鼠自由飲食，設置光/暗周期為12 h/12 h，背景噪音控制在(40±10)dB，飼養1 w適應環境。

1.2主要藥物與試劑 P38抗體購自武漢博士德生物公司(BA1325-2)，p-P38抗體購自北京博奧森生物科技公司(bs-2210R)，SYBR Green PCR試劑盒由美國Thermo公司(K0223)提供，溫陽振衰顆粒由湖南中醫藥大學第一附屬醫院(201606)提供，依那普利由山東辰欣藥業股份有限公司提供(H20083605)，鹽酸阿霉素(ADR)由深圳萬樂藥業有限公司提供(201708)。

1.3CHF模型建立 將ADR用生理鹽水配置為2.0 mg/ml，按1.5 ml/kg進行大鼠腹腔注射造模，每周1次，連續6 w，每次注射前均重新測量體重，以此作為注射劑量的依據〔5〕。

1.4分組 從40只實驗大鼠中隨機抽取30只使用ADR進行造模，余10只為正常對照組。在第3次注射ADR后6 d對所有實驗大鼠行心臟彩超檢查，根據彩超結果進行分層，再使用隨機區組設計將30只實驗大鼠分為模型對照組、溫陽振衰組及陽性對照組〔4〕。

1.5給藥方法 自第3次注射ADR后7 d開始，溫陽振衰組用溫陽振衰顆粒按1.44 g/(kg·d)進行灌胃，2次/d，3 ml/次，連續灌胃4 w。陽性對照組使用依那普利按1.8 mg/(kg·d)進行灌胃，每天灌胃2次，每次3 ml，連續4 w。正常對照組用生理鹽水進行灌胃，每天2次，每次3 ml，連續4 w〔4〕。

1.6心臟彩超檢查 選擇左室射血分數(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)、左室收縮末內徑(LVSD)、左室舒張末內徑(LVDD)5個心臟彩超常用指標作為檢查指標，取5個心動周期求平均值。

1.7Western印跡檢測 取心肌組織總蛋白50 μg并加入2×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，在100℃環境中持續變性8 min后，使用16 mA/gel恒定電流電泳15 min，再修改為32 mA/gel恒定電流電泳至底部。按膜面積0.8 mA/cm2設定恒定電流進行電轉印，加入一抗并在4℃環境中過夜后加入酶標二抗，在室溫中雜交2 h。TBST漂洗3次，每次10 min，后ECL曝光顯像，掃描，保存，分析。

1.8RT-PCR檢測 從液氮罐中取出保存的實驗大鼠心肌組織，登錄NCBI基因庫并從中查詢LncRNA BIC、miR-155和P38MAPK的基因序列，根據相應引物序列設計引物，嚴格按照PCR反應試劑盒說明書進行熒光定量RT-PCR分析。LncRNA BIC-上游引物：CTATCAGTGGCTACCAACC，下游引物：AACAGTTACACAGCCTTCA ，長度101 bp；miR-155-上游引物：GGGTTAATGCTAATTGTG，下游引物：AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC，長度61 bp；P38MAPK-上游引物：TGCCTTCCTCTACTCCAT，下游引物：TAGCCAGAAAGTCCATCA，長度98 bp；內參U6-上游引物：GCTTCGGCACGTAACATATACTAAAAT，下游引物：CGCTTCACGACCTAGTGCGTGTCAT，長度89 bp。

1.9統計學方法 使用SPSS19.0統計軟件進行單因素方差分析、LSD法、TamhaneT2法。

2 結 果

2.1實驗后各組心功能LVEF、LVFS的變化 各實驗組LVEF、LVFS較正常對照組顯著降低(P<0.05)，藥物干預兩組LVEF、LVFS較模型對照組差異有統計學意義(P<0.05)，其中溫陽振衰組效果改善LVEF效果最為顯著，與陽性對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2實驗后各組心功能LVSD、LVDD比較 各實驗組LVSD、LVDD較正常對照組顯著增高(P<0.05)，藥物干預兩組LVSD、LVDD較模型對照組有所降低，差異有統計學意義(P<0.05)，溫陽振衰組與陽性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組心功能LVEF、LVFS、LVSD、LVDD及心肌P38MAPK與p-P38MAPK表達比較

2.3各組心肌p-P38MAPK與P38MAPK的表達 各實驗組心肌p-P38MAPK表達較正常對照組顯著升高(P<0.05)。溫陽振衰組上調程度較陽性對照組更緩，差異有統計學意義(P<0.05)，各組心肌P38MAPK表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表1，圖1。

1～4:正常對照組、模型對照組、溫陽振衰組、陽性對照組圖1 各組心肌P38MAPK與p-P38MAPK的表達

2.4各組心肌LncRNA BIC、miR-155及P38MAPK mRNA的表達 實驗后各實驗組心肌LncRNA BIC和miR-155表達明顯低于正常對照組(P<0.05)。溫陽振衰組下調程度最為緩慢，差異有統計學意義(P<0.05)，各組心肌P38MAPK mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表2，圖2。

表2 各組心肌LncRNA BIC、miR-155及P38MAPK mRNA的表達

圖2 各組心肌LncRNA BIC、miR-155及P38MAPK mRNA的表達

3 討 論

細胞是組成生命的基本結構，細胞的結構和功能改變都是以一系列細胞內信號轉導為基礎。MAPK是機體應激反應、炎性刺激、血管生成、凋亡誘導的信號通路反應中樞，P38MAPK是MAPK家族中的四大亞族之一，是介導細胞炎性反應的主要信號通路蛋白。P38MAPK被上游調控基因或環境相關因素刺激激活后，可以通過磷酸化修飾進而激活多種轉錄因子，形成心肌細胞的級聯式炎性瀑布反應，導致心肌細胞損傷〔7，8〕。miR-155屬于短鏈非編碼RNA，雖然不具備傳統中心法則編碼蛋白質的功能，但可通過影響MKK-3及MKK-6從而對P38MAPK的表達進行調控，從而影響P38MAPK的蛋白磷酸化表達量。在心血管系統疾病領域，miR-155有廣泛的調控作用，有報道顯示過表達miR-155可以顯著增加心肌干細胞移植成功率，且上調miR-155可以對炎性因子白細胞介素(IL)-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α有明顯的抑制作用〔9～13〕。作為miR-155的直接編碼基因LncRNA BIC，人類LncRNA BIC于2001年被發現，而大鼠的LncRNA BIC直到2015年11月15日才正式上傳至NCBI基因數據庫，因此，LncRNA BIC調控miR-155進而影響P38MAPK這條信號通路極具研究價值。

溫陽振衰顆粒由湖南省名中醫陳新宇教授創制，該中藥復方由附子、干姜、甘草、紅參等六位中藥組成。方中君藥附子具有溫補腎陽，扶陽破陰，一掃陰霾之功；紅參具有回陽救逆，復脈固脫，振奮心陽之效〔14〕。炙甘草調和諸藥，亦兼補土功效，需知“火得土覆方可久存”〔15〕。前期課題組證實了P38MAPK的蛋白磷酸化程度與CHF的發展呈顯著正相關性，溫陽振衰顆粒可以抑制P38MAPK蛋白磷酸化的過度表達〔4〕。本研究結果說明，LncRNA BIC和miR-155的高表達對心肌細胞有保護作用，且LncRNA BIC/miR-155可能通過調控P38MAPK的蛋白磷酸化從而介導炎性反應，溫陽振衰顆粒有可能通過上調心肌細胞中LncRNA BIC/miR-155的表達進而抑制P38MAPK蛋白過度磷酸化后介導的炎性因子對心肌細胞的損傷作用，這可能是溫陽振衰顆粒治療CHF的重要分子機制之一。