阿托伐他汀鈣對冠心病患者外周血炎癥因子及單核細胞極化的影響

魯琦 李論

(武漢市第四醫院 華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院心血管內科，湖北 武漢 430033)

冠心病是指冠狀動脈在粥樣硬化的基礎上發生管腔狹窄或閉塞，從而導致心肌缺血缺氧甚至壞死的心臟疾病〔1〕。據推算，我國冠心病現患人數已達1 100萬例，其中心臟病死亡率為144.79/10萬，且呈逐年上升階段〔2，3〕。目前，冠心病的主要治療方式為藥物治療。阿托伐他汀鈣作為他汀類降脂藥物已逐漸廣泛應用于冠心病的治療。本研究擬探討阿托伐他汀鈣對冠心病的治療效果及其作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 2016年6月至2018年6月在武漢市第四醫院心內科診治的冠心病患者110例按隨機數表法分為對照組及干預組各55例。納入標準：符合美國心臟協會(AHA)、美國心臟病學會(ACC)診斷標準：左冠狀動脈主干(LM)、左前降支(LAD)、左回旋支(LCX)、右冠狀動脈(RCA)中至少一支冠狀動脈狹窄程度≥50%；心功能Ⅰ、Ⅱ級。排除標準：發病前2個月內服用過他汀類藥物；合并自身免疫性疾病或惡性腫瘤；合并嚴重肺部、肝腎功能不全；合并急慢性感染；近3個月內有外傷或手術史。入院時詳細收集各組臨床資料及輔助檢查結果。本研究經武漢市第四醫院倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。兩組年齡、性別、吸煙史、體重指數(BMI)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高血壓發生率、糖尿病發生率及冠狀動脈病變累及支數比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2主要試劑 人腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，人高遷移率族蛋白(HMG)B1 ELISA檢測試劑盒購自日本世諾有限公司，人單核細胞分離液試劑盒購自天津市灝洋生物制品有限公司，胎牛血清、RPMI1640培養基購自美國Gibco公司，Trizol裂解液購自美國Invitrogen公司，逆轉錄和實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)試劑盒購自TaKaRa公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、細胞及免疫沉淀(IP)裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司，誘導型一氧化氮合酶(iNOS)抗體購自美國Santa Cruz公司，精氨酸酶(Arg)-1及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自美國CST公司。

1.3方法 對照組給予傳統治療方案：阿司匹林腸溶片(廠家：Bayer S.p.A.有限公司；批準文號：國藥準字J20130078)，100 mg/次，1次/d，口服；及單硝酸異山梨酯片(廠家：阿斯利康制藥有限公司；批準文號：國藥準字H20030417)，30 mg/次，1次/d，口服。連續用藥2個月。干預組在傳統治療方案的基礎上加用阿托伐他汀鈣片(廠家：輝瑞制藥有限公司；批準文號：國藥準字J20030048)，20 mg/次，1次/晚，口服。連續服藥2個月。

1.4觀察指標

1.4.1療效評價 根據患者心絞痛癥狀發作情況評估治療效果：顯效為治療后心絞痛發作頻次降低≥80%；有效為治療后心絞痛發作頻次降低程度介于50%～79%；無效為治療后心絞痛發作頻次降低<50%〔4〕。顯效率+有效率=總有效率。

1.4.2血清中TNF-α、HMGB1水平檢測 于服藥前及服藥2個月后，所有患者空腹抽取外周血，室溫、4 000 r/min離心獲取血清，于-80℃儲存。嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測血清中TNF-α及HMGB1水平。

1.4.3外周血單核細胞提取 于服藥前及服藥2個月后，所有患者空腹抽取外周血，將血液標本與磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋混勻，將混合液輕輕置于分離液上，于3 000 r/min、4℃條件下離心30 min。離心后出現分層，取第二層白膜細胞，PBS洗滌，獲取單核細胞備用。

1.4.4RT-q-PCR法檢測外周血單核細胞中iNOS、Arg-1 mRNA的表達 取1×106個單核細胞，加入1 ml Trizol，提取總RNA，測定RNA濃度及D260/D280；按照TaKaRa RR047A逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，再按照TaKaRa RR820A進行RT-qPCR檢測。以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法分別計算iNOS、Arg-1 mRNA的表達量。具體引物序列如下：iNOS上游：5′-GGAGCCAGCTCTGCATTATC-3′，下游：5′-TTTTGTCTCCAAGGGACCAG-3′；Arg-1上游：5′-CCCCAGTACCAACAGGACTACC-3′，下游：5′-TGAACGTGGCGGAATTTTGT-3′； GAPDH上游：5′-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游：5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.4.5Western印跡法檢測iNOS及Arg-1的蛋白表達 取1×106個單核細胞，用細胞及IP裂解液裂解細胞并提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，制備蛋白樣品，80 V恒定電壓電泳30 min后調節為120 V繼續電泳90 min，切膠、轉膜，5%脫脂奶粉封閉，4℃一抗過夜，TBST洗滌后二抗孵育，電化學發光顯色，BioRad系統曝光，Quantity one分析圖片。

1.5統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1兩組治療后療效比較 干預組的總體有效率顯著高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組療效比較〔n=55,n(%)〕

2.2兩組治療前后血清HMGB1及TNF-α及蛋白水平比較 治療前，兩組血清中HMGB1及TNF-α水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療后，兩組HMGB1及TNF-α水平均顯著下降(P<0.05)。同時，治療后干預組HMGB1及TNF-α水平均明顯低于對照組(P<0.001)。見表3。

表3 兩組治療前后血清HMGB1及TNF-α水平比較

2.3兩組治療前后外周血單核細胞中iNOS、Arg-1 mRNA及蛋白水平比較 兩組治療前，外周血單核細胞中iNOS、Arg-1 mRNA及蛋白表達水平差異均無統計學意義(P>0.05)。治療后，兩組iNOS mRNA及蛋白水平顯著下降，Arg-1 mRNA及蛋白水平顯著升高(均P<0.05)。治療后干預組iNOS mRNA及蛋白水平明顯低于對照組，干預組Arg-1 mRNA及蛋白水平明顯高于對照組(均P<0.05)。見表4，圖1。

表4 兩組治療前后外周血單核細胞中iNOS、Arg-1 mRNA及蛋白的表達水平比較

1～4：對照組治療前，干預組治療前，對照組治療后，干預組治療后圖1 兩組治療前后外周血單核細胞中iNOS、Arg-1蛋白表達

3 討 論

研究表明，炎癥反應在冠心病發生發展過程中具有重要作用。李志等〔5〕發現，與正常人相比，冠心病患者血清中白細胞介素(IL)-8水平明顯增高，而IL-10水平則顯著降低，且炎癥因子的表達與冠心病危險程度呈正相關，提示炎癥反應在冠心病進程中發揮重要作用。另一項研究發現，急性心肌梗死患者血清中炎癥因子IL-6及TNF-α水平顯著增高，炎癥反應與病情程度密切相關，在病情評估上具有一定應用價值〔6〕。因此，抑制炎癥反應則可能改善冠心病的病情，延緩疾病進展。

阿托伐他汀鈣除具有調脂作用外，其還具有抗炎、改善血管內皮功能、抑制血管平滑肌增殖、防止血栓形成及穩定斑塊等作用〔7，8〕。對于急性腦梗死患者，阿托伐他汀可明顯降低血清中炎癥因子IL-6、內皮素及單核細胞趨化因子1〔9〕。阿托伐他汀還可明顯調節冠心病患者血脂水平、降低血清超敏C反應蛋白及改善左室射血分數，從而有助于延緩冠狀動脈粥樣硬化進程〔10〕。而Zhao等〔11〕研究發現，在自發性高血壓大鼠中，阿托伐他汀可明顯降低血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α及轉化生長因子β，改善腎臟病理損害，其抗炎機制可能與增加過氧化物酶體增殖激活受體-γ的表達有關。本研究也發現阿托伐他汀在冠心病上也具有良好的抗炎作用。

單核-巨噬細胞系統是人體內天然免疫系統的重要組成部分，根據其細胞表面標記物的不同，可將其分為經典活化的單核-巨噬細胞(M1型)及選擇性活化的單核-巨噬細胞(M2型)〔12〕。單核-巨噬細胞極化在冠心病的發生發展過程中也發揮了重要作用〔13〕。在心肌梗死早期，心臟局部的巨噬細胞主要分化為M1型，可分泌大量炎癥因子從而介導心肌細胞及內皮細胞的損傷；而在后期，巨噬細胞則向M2型轉化，并促進梗死心肌的修復重塑〔14〕。研究表明，巨噬細胞極化還可參與維持冠脈中斑塊穩定性的調節，M1型巨噬細胞通過分泌大量炎癥因子，使得斑塊內環境中基質金屬蛋白酶水平上升，后者可促進斑塊周圍纖維基質的水解，從而降低斑塊穩定性；而具有抗炎作用的M2型巨噬細胞則可抑制上述炎癥反應的發生，從而維持斑塊穩定性〔15〕。因此，調節巨噬細胞的M1/M2極化可作為冠心病防治的一個潛在靶點。

綜上，阿托伐他汀對冠心病有治療作用，其可促進外周血單核細胞呈M2型極化，從而發揮抗炎作用，提高治療效果。