糜子幼胚愈傷組織的誘導及植株再生

吳會琴，王 娜，黃夢迪，劉蓓蓓，楊 璞，高小麗

(西北農林科技大學 農學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

糜子(PanicummiliaceumL.)是禾本科最古老的1a生草本作物之一[1]。因其生育期短，抗旱能力強，是中國重要的搶險救災作物，并被廣泛用作儲備作物和動物飼料[2]。糜子主要分布在中國的陜西、山西、甘肅、寧夏、內蒙等干旱半干旱地區[3]，是當地重要的糧食作物和經濟作物。糜子富含蛋白質和礦質營養元素，是現代健康功能食品開發的重要資源[4]。但因品種和生態環境等因素的限制，糜子的產量相對較低，在一定程度上限制了糜子產業的發展，所以，提高產量和改善品質已然是糜子育種工作的重要目標[5]。

近年來，隨著生物技術的發展，通過組織培養和基因工程等手段定向改良品種已成為作物研究的一個重要方向，而通過生物技術途徑進行遺傳改良的首要環節就是建立穩定高效的離體培養體系。目前，已經有很多關于小麥[6]、玉米[7]、水稻[8]、高粱[9]等禾谷類作物再生體系建立的報道，其中，幼胚為應用較多且較為理想的外植體之一，并且通過幼胚誘導愈傷組織并獲得再生植株，從而進行遺傳轉化等相關工作。但目前有關糜子再生技術體系的研究仍處于探索階段，尚不能滿足種質改良和遺傳育種工作的需求。因此，本試驗以‘陜糜1號’和‘陜糜2號’2種糜子的幼胚作為外植體材料，旨在通過篩選適宜糜子幼胚誘導分化的培養基及激素，建立并優化糜子幼胚愈傷組織誘導及植株再生體系，以期為糜子高效育種和遺傳改良等研究奠定理論和技術基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以糯性糜子品種‘陜糜1號’和粳性糜子品種‘陜糜2號’為試驗材料，均由西北農林科技大學農學院小雜糧課題組提供。

1.2 試驗所用培養基

如表1所示，2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸，2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)、KT(激動素，Kinetin)，所有培養基均添加30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂，pH均為5.8，121 ℃高溫高壓滅菌20 min， 備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 外植體的培養 糜子開花后8～10 d，于每天9：00-10：00，剪下穗子，插入自來水中，用冰盒帶回。置于4 ℃冰箱內對穗子進行低溫預處理培養，處理時間分別為1(CK)、2、3、4、5、6、7 d，接種前將穗子在自來水下沖洗10 min，然后在超凈工作臺中用體積分數為75%的乙醇和質量分數為20%的次氯酸鈉溶液分別消毒2 min、15 min，然后用無菌水沖洗3次，將穗子置于無菌濾紙上吸干水分，備用。

表1 誘導培養基種類Table 1 Types of induction medium

1.3.2 愈傷組織的誘導 在超凈工作臺中用鑷子剝去穗子外殼，將里面的白色半透明幼胚接種在誘導培養基上，每個三角瓶中接種20粒幼胚。 (27±1) ℃黑暗條件下誘導培養，期間注意觀察，及時清理污染樣品。14 d后繼代1次，21 d后統計糜子幼胚的愈傷組織誘導率。各試驗處理重復3次。

1.3.3 愈傷組織的分化 將生長良好的愈傷組織轉接到愈傷組織分化培養基上，每個三角瓶接種5塊愈傷組織。分化培養基為MS培養基中添加1.0 mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤，6-Benzylaminopurine)和不同質量濃度的NAA(萘乙酸，1-Naphthaleneacetic acid)(0、0.1、0.5 mg/L)，在(30±1) ℃下16 h/8 h(亮/暗)散光培養。21 d后統計綠點率和出芽率(芽長1 cm視為出芽，小于1 cm視為出現綠點)，每2周更換1次培養基。

1.3.4 生根培養及煉苗移栽 待到幼苗長到3 cm左右的時候，將其轉接到生根培養基中進行生根培養，生根培養基為1/2MS+NAA(0.1 mg/L)，(27±1) ℃黑暗培養14 d后打開三角瓶口，煉苗2～3 d后將其移入盛有基質的花盆里。

1.4 數據分析與統計

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 16.0對數據進行處理和比較分析。

愈傷組織誘導率=(產生愈傷組織的外植體數/接種的外植體總數)×100%

綠點率=(產生綠點的愈傷組織塊數/接種的愈傷組織總塊數)×100%

出芽率=(產生芽的愈傷組織塊數/接種的愈傷組織總塊數)×100%

2 結果與分析

2.1 不同低溫預處理時間對糜子幼胚愈傷組織誘導的影響

由圖1可知，適當的4 ℃低溫預處理有助于糜子幼胚誘導產生愈傷組織，經過3 d低溫預處理，‘陜糜1號’和‘陜糜2號’幼胚愈傷組織誘導率均達到最高，分別為60.38%、56.61%。第4天，糜子幼胚愈傷組織誘導率開始下降，但與低溫預處理2 d相比，其仍然有較高的愈傷組織誘導率。隨著處理時間的增加，幼胚愈傷組織誘導率繼續呈下降趨勢。低溫預處理6 d后，‘陜糜1號’幼胚愈傷組織誘導率顯著低于對照；‘陜糜2號’與對照無明顯差異。綜上結果，低溫預處理 3 d對提高糜子的幼胚愈傷組織誘導率有積極 作用。

2.2 不同質量濃度2,4-D對糜子幼胚愈傷組織誘導的影響

植物生長調節劑對植物的快速繁殖有著至關重要的作用，不僅影響植物細胞自身的全能性表達，還可以通過與內源激素的相互作用影響細胞的分裂和分化[10]。

不同字母表示不同處理間差異顯著性(P<0.05)，下同

添加2,4-D對‘陜糜1號’‘陜糜2號’幼胚誘導產生愈傷組織有重要意義(圖2)。在MS和N6 2種基本培養基，分別單獨添加不同質量濃度的2,4-D，糜子幼胚的愈傷組織誘導率顯著不同?？傮w而言，隨著2,4-D質量濃度的增加，‘陜糜1號’、‘陜糜2號’幼胚的愈傷組織誘導率均呈現出先增加后降低的趨勢，而且2種糜子幼胚的愈傷組織誘導率為20.00%～65.85%。并且二者的愈傷組織誘導率，均在2,4-D 質量濃度為3 mg/L時達到最大，分別為65.85%(‘陜糜1號’)、 59.16%(‘陜糜2號’)，且與其他處理存在顯著 差異。

‘陜糜1號’和‘陜糜2號’均在M3培養基顯示出最高的愈傷組織誘導率。同時，僅在M3培養基中，‘陜糜1號’和‘陜糜2號’的出愈率均達到50%以上，但在M2培養基中，2個糜子品種的幼胚也存在較高的愈傷組織誘導率，甚至高于N3培養基。由此可見，MS培養基比N6培養基更適合‘陜糜1號’和‘陜糜2號’進行幼胚愈傷組織誘導。因此，可以選擇M3培養基做‘陜糜1號’和‘陜糜2號’幼胚的愈傷組織誘導培養基。

圖2 不同2,4-D濃度下的糜子幼胚愈傷組織誘導率Fig.2 Frequency of callus induction from immature embryo of proso millet under different 2,4-D concentration

2.3 不同質量濃度2,4-D和KT對糜子幼胚愈傷組織誘導的影響

2.3.1 對‘陜糜1號’的影響 在植物再生體系建立中，將低質量濃度的KT配合較高質量濃度的2,4-D使用，是誘導愈傷組織的常見方法之一[11]。圖3為‘陜糜1號’的幼胚在2,4-D與KT組合的培養基中的愈傷誘導情況。比較發現，在不添加KT的情況下，隨著2,4-D質量濃度的增加，愈傷組織誘導率呈現先升高后降低的趨勢，且IM5培養基中，‘陜糜1號’的幼胚愈傷組織誘導率最高，為65.85%；添加了KT后，愈傷組織的質量明顯得到改善，在IM7培養基中，‘陜糜1號’的幼胚愈傷組織誘導率與其他添加了KT的愈傷組織誘導率存在顯著差異。本研究還發現，IM9、IM10、 IM11、 IM12、IM21、 IM22、 IM23和IM24培養基中，幼胚的愈傷組織容易發生褐化，也有少量會出現水漬狀愈傷組織，同時期其他培養基中并未出現此種情況，說明2,4-D質量濃度過高易導致‘陜糜1號’幼胚愈傷組織褐化。在IM7培養基中，得到的愈傷組織質量最佳，塊大，致密，顏色淡黃或者白色。因此，2,4-D和KT的組合中，IM7培養基較適合‘陜糜1號’的幼胚愈傷組織誘導。

圖3 不同質量濃度2,4-D和KT下的‘陜糜1號’幼胚愈傷組織誘導率Fig.3 Frequency of callus induction from immature embryo of Shaanmi No.1 under different concentrations of 2,4-D and KT

2.3.2 對‘陜糜2號’的影響 基因型對幼胚誘導愈傷組織有很大影響[12]。如圖4所示，在IM13、 IM14、 IM15、 IM16、 IM17、 IM18、 IM19、 IM20、 IM21、 IM22、 IM23和IM24培養基中，‘陜糜2號’的幼胚愈傷組織誘導率在IM16、IM20、IM24 3種培養基中均達到同2,4-D質量濃度組合最高，分別為44.92%、43.59%、47.68%，且與其他組合存在顯著差異，說明在N6培養基中添加KT有利于促進幼胚誘導形成愈傷組織。而在MS培養基中，‘陜糜2號’幼胚愈傷組織誘導率達到最高時(59.27%)，KT的質量濃度仍為0 mg/L。同時，在IM6培養基中得到了質量較好的愈傷組織，這與‘陜糜1號’在MS培養基中的響應存在一定差異，可能是由基因型的差異影響了愈傷組織誘導效率和產生的愈傷組織類型。因此，選擇IM6培養基為‘陜糜2號’的幼胚愈傷組織最佳誘導培養基，在IM16、IM20、IM24 3種培養基的基礎上進一步深入研究N6培養基對‘陜糜2號’的幼胚愈傷組織誘導的 影響。

圖4 不同質量濃度2,4-D和KT下的‘陜糜2號’幼胚愈傷組織誘導率Fig.4 Frequency of callus induction from immature embryo of Shaanmi No.2 under different mass concentrations of 2,4-D and KT

2.4 不同質量濃度6-BA和NAA對糜子幼胚愈傷組織分化的影響

由表2可知，在1.0 mg/L 6-BA和不同質量濃度NAA中，‘陜糜1號’和‘陜糜2號’的愈傷組織綠點率及出芽率不同。當NAA 質量濃度為0.1 mg/L時，‘陜糜1號’和‘陜糜2號’的綠點率均達到最高，分別為83.33%、88.33%，同時，其出芽率也達到最大值(36.67%、50.00%)。所以，本研究選擇MS+1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA為適宜糜子幼胚愈傷組織分化的培養基。糜子幼胚愈傷組織誘導及植株再生過程見圖5。

表2 不同質量濃度6-BA和NAA下的糜子幼胚愈傷組織綠點率及出芽率Table 2 Rate of green spot and bud induction from immature embryo calli of proso millet under different mass concentrations of 6-BA and NAA

a/A. 接種后14 d的幼胚愈傷組；b/B.繼代一次的愈傷組織；c/C.轉分化后14 d的幼胚愈傷組織；d/D.再生幼苗；f/F. 再生植株(a-f.‘陜糜1號’；A-F.‘陜糜2號’)

3 討 論

3.1 不同低溫預處理時間對糜子幼胚愈傷組織誘導的影響

低溫預處理可以提高愈傷組織誘導率[13-14]。但是，對于低溫預處理的具體影響，學者們之間的看法不盡一致。有研究表明，低溫預處理可以顯著提高水稻花藥和成熟胚的出愈率和分化率[15-17]，而馮明芳等[18]研究發現，黑龍江粳稻成熟胚愈傷組織誘導率會降低，但分化率顯著提高；胡雪丹等[19]綜合比較， 低溫預處理2 d為葫蘆花藥愈傷誘導的最佳處理時間；周玉麗等[20]等的研究結果則是低溫預處理1 d，可以得到較高的甜葉菊愈傷組織率。本研究結果表明，低溫預處理3 d有利于糜子幼胚愈傷組織的形成。與前人研究結果不完全相同，可能是植物種類及所選外植體不同，使外植體在脫分化時對低溫處理的響應不同所致。

3.2 不同質量濃度2,4-D對糜子幼胚愈傷組織誘導的影響

2,4-D作為一種常見的植物激素，對植物愈傷組織誘導有重要影響，且有學者研究表明，2,4-D是誘導形成愈傷組織的必要條件[21]。當培養基中僅含有2,4-D時，外植體更容易產生愈傷組織，且2,4-D的最佳質量濃度為2.0 mg/L[22]。王晶晶[23]研究發現，2,4-D質量濃度為1.5～2.0 mg/L時，小麥幼胚的繼代培養效果最好，其中 2,4-D為2.0 mg/L時，甚至繼代5次后，再生率還高達29.8%。楊玉潔等[24]在對直立冬青幼胚愈傷組織的誘導分化研究中，發現在培養基中添加0.5～2.0 mg/L 2,4-D時，對其幼胚誘導有積極作用，得到的幼胚誘導率最高。本研究結果發現，當2,4-D質量濃度為3.0 mg/L時，糜子幼胚誘導出的愈傷組織質量好且誘導率較高，這與徐鳳等[25]在節節麥的幼胚再生體系建立中的結論一致。本研究也表明，2,4-D質量濃度過高或者過低，均會導致幼胚愈傷組織誘導率的下降，且當2,4-D達到較高的質量濃度時，愈傷組織容易發生褐變，這與彭瓊等[26]的研究結果一致。

3.3 不同質量濃度2,4-D和KT對糜子幼胚愈傷組織誘導的影響

國內有相關研究發現[23]，在小麥組織培養中，在誘導和繼代培養基中添加0.5 mg/L KT和2,4-D配合使用，將顯著提高小麥幼胚的愈傷組織誘導率和分化率。徐鳳等[25]在節節麥的幼胚體系建立中，發現KT對節節麥幼胚愈傷組織分化有著顯著影響，且以KT濃度為1.0 mg/L時最佳。Asakura等[22]對番茄外植體再生能力進行比較，結果顯示，在MS培養基中添加2,4-D和KT，未成熟胚愈傷組織誘導率從42.4%到100%不等，其中，最適合番茄未成熟胚愈傷組織誘導的激素組合為2,4-D 2.0 mg/L和KT 5.0 mg/L。而別曉敏等[27]則認為適宜小麥幼胚愈傷組織誘導的的最佳激素組合為2,4-D 2.0 mg/L和ABA 0.3 mg/L。本試驗也選擇在2,4-D的基礎上，添加一定質量濃度的KT，優化糜子幼胚愈傷組織誘導體系，研究結果證明，添加低質量濃度的KT對愈傷組織的誘導率沒有顯著影響，但是可以明顯改善愈傷組織的質量，這與李惠[11]的研究結果相同。

此外，本研究還發現，‘陜糜2號’在N6+ 2,4-D+KT(1.5 mg/L)的組合中，即IM16、IM20、IM24培養基中均表現出了較高的愈傷組織誘導率，雖然低于僅含有2,4-D的培養基，但是，較之低質量濃度的KT組合，愈傷組織誘導率已經顯著提高，因不知持續增加KT的質量濃度，出愈率變化的趨勢，所以暫時認定低質量濃度的KT對糜子幼胚愈傷組織誘導影響不大，但尚不能確定高質量濃度的KT對幼胚誘導率的影響，Asakura等[22]的研究結果在一定程度上為本研究的后續工作提供了依據。

3.4 不同質量濃度6-BA和NAA對糜子幼胚愈傷組織分化的影響

MS培養中添加不同質量濃度的6-BA和NAA對植物愈傷組織分化有較大影響[28-29]。李揚等[30]認為適于野生一粒小麥的6-BA質量濃度為0.5 mg/L，且6-BA質量濃度較高會使愈傷組織的褐化率升高，分化率降低，與本研究結果不盡一致，應是由作物對激素的耐受力不同引起的。郭伶娜等[31]通過試驗得到，在只添加6-BA的培養基中，高羊茅的分化成苗率為33.1%，與本研究的結果相同。同時，他們還發現當6-BA和NAA配合使用時，可以促進愈傷組織分化成苗。本研究結果也顯示，在MS培養基中，當6-BA的濃度為1.0 mg/L，NAA 的質量濃度為0.1 mg/L時，糜子幼胚愈傷組織的綠點率和出芽率均為最高，體現了6-BA和NAA的組合對愈傷組織分化的積極作用，這可能是因為NAA的主要功能是誘導芽的生長和促進生根，可以有效地吸收培養基中的營養成分[32]。

4 結 論

4 ℃低溫預處理3 d對糜子幼胚愈傷組織誘導最有利。在M3培養基中，‘陜糜1號’和‘陜糜2號’的幼胚愈傷組織誘導率均達到最大值；且在培養基中添加低濃度的KT可以明顯改善愈傷組織質量，其中，2,4-D和KT的組合中，適宜‘陜糜1號’幼胚愈傷組織誘導是IM7培養基，適宜‘陜糜2號’幼胚愈傷組織誘導是IM6培養基，存在基因型差異；適宜糜子幼胚愈傷組織分化的培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA。