生防細菌復配對蘋果主要病原真菌抑菌活性篩選及其穩定性

李恩琛，張文軍，張樹武，徐秉良，劉 佳

(甘肅農業大學 植物保護學院，甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，蘭州 730070)

蘋果是世界上栽培面積最廣的的水果之一，其富含維生素及人體必須的微量元素[1]。目前，中國是世界蘋果生產大國，無論是栽植面積，還是年均產量均居世界第一[2]。然而，蘋果病害已經嚴重影響蘋果產量和質量，制約著蘋果產業的發展。當前，蘋果病害的防治仍以化學農藥為主，但是其大量或不合理使用，不但對人畜及環境造成嚴重危害，而且能夠導致病原菌產生抗藥性[3-5]。微生物防治蘋果病害具有諸多優點，如對環境安全、對有益微生物無影響、對人畜健康有利、兼防兼治、促生等，是一種無公害植保新技術，目前對于微生物防治蘋果病害的研究較多，如鄧振山等[6]分離出的4株蘋果樹內生真菌均對蘋果樹腐爛病菌有較強的抑制作用；馬志峰等[7]研究表明EM活性菌泥對蘋果樹腐爛病防治效果好，能有效促進病疤的愈合；王洋娟[8]研究指出，多年施用微生物菌肥能明顯改善蘋果花臉和腐爛病發病情況。

近年來，生防細菌由于其繁殖速度快，不污染環境，對人畜健康安全，其分泌的拮抗物質不僅對病原菌有較強的抑制作用，而且容易生產，成本低，所以生防細菌在農業生產中具有廣泛的應用前景，尤其在蘋果病害防治中已成為目前研究的熱點之一[9-13]。然而，相關學者研究表明，單一生防細菌菌劑在實際生產中存在對環境適應能力弱，效果不顯著和穩定性差等弊端，但是不同生防菌株間混配使用可以優勢互補，增強生物防治效果，提高穩定性[14]。陳志誼等[15]研究表明拮抗細菌間的混合使用可以有效提高對植物病害的防治效果；葛紅蓮等[16]研究發現復合細菌菌劑PB12不僅能夠有效防治黃瓜疫病，而且能夠促進黃瓜幼苗生長，改善土壤酶活性。因此，將不同拮抗細菌進行復配可以在一定程度上解決單一生防菌在實際應用中存在的許多問題，更好的防治蘋果病害。同時，已有研究表明不同溫度、酸堿度和紫外線照射等條件對生防細菌的抑菌活性具有顯著的影響，如牛偉等[17]研究發現枯草芽孢桿菌B26粗提物對高溫具有一定的耐受性，對pH有比較寬的適應范圍，但紫外照射對其抑菌活性有一定影響。然而，目前有關不同溫度、酸堿度和紫外線照射等條件對生防細菌抗蘋果主要病原菌活性方面研究較少。

本試驗以5種蘋果主要病原菌為研究對象，測定不同生防細菌及其復配的室內抑菌效果，以及復配生防細菌發酵液在不同環境下對蘋果樹腐爛病菌的抑制效果及穩定性變化，旨在為后期新型微生物藥劑的研制與應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試病原菌 蘋果樹腐爛病菌(Valsamali)、蘋果炭疽葉枯病菌(Glomerellacingulata)、蘋果輪紋病菌(Macrophomakawatsukai)、蘋果霉心病菌(Alternariaalternata)和蘋果斑點落葉病菌(A.mali)均由甘肅農業大學植物保護學院植物病理學實驗室保存。

1.1.2 供試生防細菌 解淀粉芽孢桿菌TS-1203(TS-1203)(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌BS-1208(BS-1208)(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌GS-1209(GS-1209)(B.licheniformis)和多粘類芽孢桿菌FS-1206(FS-1206)(Paenibacilluspolymyxa)均由甘肅農業大學植物保護學院植物病理學實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 生防細菌發酵液制備 單一生防細菌發酵液的制備：在100 mL NB中接種一環在NA上活化了24 h的生防細菌，置于28 ℃、180 r/min的恒溫搖床黑暗振蕩12 h，獲得種子液。在無菌的NYBD(60 mL)培養基中接種5 mL生防細菌種子液，在同樣的條件下黑暗振蕩48 h后獲得該生防細菌發酵液。

復配生防細菌間發酵液的制備：在100 mL NB中接種一環NA上活化了24 h的生防細菌，搖床振蕩12 h，獲得種子液。在滅菌NYBD(60 mL)中加入不同比例生防細菌混合種子液5 mL(表1)，在同樣條件下搖床振蕩48 h后，可獲得生防細菌發酵液。

表1 不同生防細菌種子液復配比例Table 1 The mixture ratio of different bio-control bacteria seed solution

1.2.2 生防細菌發酵液對蘋果主要病原菌的抑菌作用測定 抑菌效果測定參考智小青等[18]采用的紙碟法和魏少鵬等[19]采用的菌絲生長速率法，對紙碟法略作修改。接種蘋果病害菌餅(d=5 mm)于平板中央，將分別蘸有單一或復配生防細菌發酵液的圓形紙片(d=6 mm)放于距離中心位置2 cm的“十”字兩端，以蘸有無菌水的圓形紙片作為對照，并置于25 ℃恒溫培養箱中黑暗培養5～7 d后，采用十字交叉法測量病原菌菌落直徑，每個處理和對照均重復3次，并計算單一和復配生防菌發酵液對蘋果病菌的抑菌活性。

抑菌率=(對照病原菌落直徑-處理病原菌落直徑)/(對照病原菌落直徑-5)×100%

1.2.3 溫度對復配生防細菌抑菌穩定性影響 依次吸取前面篩選出的最佳復配生防細菌發酵液20 mL置于無菌試管中，經30 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃和100 ℃不同溫度的水浴鍋中處理發酵液60 min和在120 ℃的高溫滅菌鍋中滅菌30 min，當不同溫度處理的發酵液溫度恢復至室溫時，采用紙碟法和菌絲生長速率法測定抑菌活性。對照為未進行溫度處理的復配生防細菌發酵液，每個處理重復3次。

1.2.4 紫外線對復配生防細菌抑菌穩定性影響 吸取篩選出的備用最佳復配生防細菌發酵液20 mL于直徑90 mm無菌培養皿中(不加蓋)，水平放置于254 nm紫外燈下，垂直距離20 cm，分別照射1 h、2 h、3 h、4 h、5 h和6 h。采用紙碟法和菌絲生長速率法測定抑菌活性。對照不經紫外線照射，每個處理及對照均重復3次。

1.2.5 pH對復配生防細菌抑菌穩定性影響 吸取篩選出的備用最佳復配生防細菌發酵液 20 mL于無菌試管中，利用1 mol/L HCl或 1 mol/L NaOH溶液分別調整pH為2～12，并置于28 ℃和180 r/min的恒溫搖床黑暗振蕩 12 h后調回原始發酵液pH(6.3)。采用紙碟法和菌絲生長速率法測定抑菌活性。試驗以未經pH處理的復配生防細菌發酵液作為對照，每個處理及對照均重復3次。

1.3 數據處理

試驗數據利用 Microsoft Excel 2010整理，并采用SPASS19.0統計分析軟件和Duncan氏新復極差法對數據進行方差分析及其差異顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 單一生防細菌發酵液對蘋果主要病原菌的抑制作用

4種單一的生防細菌發酵液對5種蘋果病原真菌具有不同的生長抑制作用，且不同生防細菌發酵液間存在明顯差異(圖1)。BS-1208對蘋果炭疽葉枯病菌抑菌效果最好，抑菌率達65.74%(圖1-A)；TS-1203對蘋果輪紋病菌和霉心病菌抑菌效果最好，抑菌率分別達到64.92%和 65.19%(圖1-B)；FS-1206對蘋果樹腐爛病菌和蘋果斑點落葉病菌的抑菌效果最好，抑菌率分別達到 78.19%和72.87%(圖1-C)；GS-1209對蘋果樹腐爛病菌抑制效果最好，為63.14%(圖1-D)。因此，4種單一生防細菌對5種蘋果病原真菌的抑制作用中，FS-1206對蘋果樹腐爛病菌的抑制效果最佳。

A.枯草芽孢桿菌BS-1208；B.解淀粉芽孢桿菌TS-1203；C.多粘類芽孢桿菌FS-1206；D.地衣芽孢桿菌GS-1209；1. 蘋果炭疽葉枯病菌；2. 蘋果輪紋病菌；3. 蘋果樹腐爛病菌；4.蘋果斑點落葉病菌；5.蘋果霉心病菌；圖上不同小寫字母表示經 Duncan氏新復極差法檢驗在0.05水平差異顯著，下同。

2.2 復配生防細菌對蘋果主要病原菌的抑制作用

研究結果表明，不同比例的復配生防細菌發酵液對蘋果主要病原菌的抑制作用存在明顯差異(圖2)。在不同比例的復配菌株組合中，除 FS-1206∶TS-1203 = 2∶1對蘋果樹腐爛病菌和霉心病菌的抑制效果優于單一菌株外，其他各復配組合均無顯著增效作用(圖2)。當生防細菌復配比例為FS-1206∶BS-1208=2∶1時，其對蘋果輪紋病菌抑制效果最好，抑菌率為61.03%，但顯著低于單一菌株TS-1203抑菌率64.92%(圖2-A和圖1-B)；當生防細菌復配FS-1206∶TS-1203 = 2∶1時，對蘋果斑點落葉病菌抑制效果最好，抑菌率為71.58%(圖2-B和圖3)，而單一菌株FS-1206對蘋果斑點落葉病菌抑菌率為72.87%(圖1-C)；當生防細菌復配為FS-1206∶BS- 1208∶GS-1209 = 2∶1∶1時，對蘋果炭疽葉枯病菌抑制效果最好，抑菌率為64.41%，單一菌株BS-1208抑菌率為65.74%(圖2-F和圖1-A)。FS-1206∶TS-1203 = 2∶1時,對霉心病菌抑菌率(67.99%)相比單一菌株TS-1203(65.19%)有所提高；對蘋果樹腐爛病菌抑菌率為86.64%，顯著高于最優單一菌株FS-1206的抑菌率 78.19%。因此，在所有復配組合中，當生防細菌FS-1206和TS-1203復配且復配比例為2∶1時，對腐爛病菌的抑制效果最好(圖3)，與單一菌株相比能顯著提高對腐爛病菌的抑菌活性。

A.多粘類芽孢桿菌FS-1206和枯草芽孢桿菌BS-1208；B.多粘類芽孢桿菌FS-1206和解淀粉芽孢桿菌TS-1203；C.多粘類芽孢桿菌FS-1206和地衣芽孢桿菌GS-1209；D.多粘類芽孢桿菌FS-1206、解淀粉芽孢桿菌TS-1203和枯草芽孢桿菌BS-1208；E.多粘類芽孢桿菌FS-1206、解淀粉芽孢桿菌TS-1203和地衣芽孢桿菌GS-1209；F.多粘類芽孢桿菌FS-1206、枯草芽孢桿菌BS-1208和地衣芽孢桿菌GS-1209;1. 蘋果炭疽葉枯病菌；2. 蘋果輪紋病菌；3. 蘋果樹腐爛病菌；4.蘋果斑點落葉病菌；5.蘋果霉心病菌

2.3 溫度對復配生防細菌FS-1206與TS-1203抑菌穩定性影響

不同溫度處理對復配生防細菌FS-1206與TS-1203的抑菌活性具有不同程度的影響。與對照相比，當處理溫度為30～80 ℃時，其對復配生防細菌FS-1206與TS-1203發酵液的抑菌活性無顯著影響，但是當處理溫度為100 ℃和120 ℃時，其抑菌活性逐漸降低，與對照相比差異顯著(圖4)。

2.4 紫外線對FS-1206與TS-1203復配后抑菌穩定性影響

不同時間紫外照射處理對復配生防細菌FS-1206與TS-1203的抑菌活性具有不同程度的影響。與對照相比，當紫外照射時間在≤3 h時，其對復配生防細菌FS-1206與TS-1203發酵液的抑菌活性影響較小。當紫外照射時間≥4 h時，其抑菌活性逐漸下降，但抑菌率均大于70%。說明發酵液對紫外光長時間的照射有較好的穩定性(圖5)。

A.炭疽葉枯病菌；B.輪紋病菌；C.腐爛病菌；D.斑點落葉病菌；E.霉心病菌；CK.CK-A～CK-E.對照

圖4 不同溫度下復配生防細菌FS-1206與TS-1203發酵液的抑菌活性Fig.4 Antifungal activity of the fermentation broth compounded with biocontrol bacteria FS-1206 and TS-1203 at different temperatures

2.5 pH對FS-1206與TS-1203復配后抑菌穩定性影響

經不同pH處理的發酵液在pH 6～9時其抑菌活性穩定，在強酸強堿條件下，發酵液對腐爛病菌的抑菌率與對照相比呈顯著性差異，但其抑菌率均大于71%，即復配發酵液中的抑菌活性物質對強酸強堿有較好的耐受性(圖6)。

3 結論與討論

本試驗結果表明，4種單一生防細菌中多粘類芽孢桿菌FS-1206對蘋果樹腐爛病菌的抑制效果最好；不同生防細菌間復配，當多粘類芽孢桿菌FS-1206∶解淀粉芽孢桿菌TS-1203=2∶1時，對蘋果樹腐爛病的抑菌效果最好，其抑菌率要顯著優于單個生防細菌多粘類芽孢桿菌FS-1206。翟一軍等[20]研究發現復配細菌生物防治效果優異，較單一菌株適應環境能力強，定殖能力好，并能誘導植物產生抗性。本試驗中將不同生防細菌混合發酵之后，發現復配生防細菌發酵液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌效果明顯優于單一生防細菌，其可能原因是兩菌株間協同增效，產生多種拮抗物質共同作用，這與申愛榮等[21]、易龍等[22]、李湘民等[23]和陶晶等[24]學者報道的兩種生防細菌復配對馬鈴薯青枯病、煙草赤星病、水稻紋枯病和番茄立枯病的防治效果優于單一菌株的研究結果一致。

圖5 紫外線不同照射時間下FS-1206與TS-1203復配后發酵液的抑菌活性Fig.5 Antifungal activity of fermentation broth after compounding FS-1206 and TS-1203 under different ultraviolet irradiation time

圖6 FS-1206與TS-1203復配發酵液在不同pH下的抑菌活性Fig.6 Antifungal activity of FS-1206 and TS-1203 mixed fermentation broth at different pH

相關研究發現，生防細菌產生的活性物質的穩定性易受到周圍環境因素的影響，多種防效良好的生防菌株由于其拮抗物質穩定性差而難以進一步利用[25]。岳東霞等[26]發現紫外線對黃瓜內生性細菌枯草芽孢桿菌B10的抑菌活性影響不明顯，而溫度過高或者酸堿度過大會明顯影響其抑菌活性。張慧等[27]研究表明紫外線照射、高溫和強酸強堿的處理對枯草芽孢桿菌CS16抑菌活性物質的穩定性影響較小。侯寶宏等[28]表明在紫外線照射、高溫和極酸極堿條件對解淀粉芽孢桿菌TS-1203發酵粗提液的穩定性有一定的影響。本試驗結果表明，FS-1206與TS-1203復配后發酵液產生的抑菌活性物質穩定性良好，其中紫外線對其抑菌活性影響較小。同時，在高溫和強酸強堿條件下，復配發酵液也具有較好的穩定性。綜上，FS-1206與TS-1203復配發酵液在蘋果樹腐爛病防治方面具有良好的應用前景。此外，關于此復配發酵液的田間試驗效果有待進一步深入研究。