超聲時(shí)間對大豆-乳清混合蛋白結(jié)構(gòu)及乳化性質(zhì)的影響

王喜波 王 琳 周國衛(wèi) 喬金文 張安琪 王玉瑩

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

0 引言

大豆分離蛋白(Soy protein isolate, SPI)與乳清分離蛋白(Whey protein isolate, WPI)是人類最重要的食源蛋白質(zhì)[1]。近年來，通過混合蛋白得到全新口感和更有利于人體健康的食品，特別是優(yōu)質(zhì)植物蛋白和優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白的混合蛋白食品越來越受到重視[2]?；旌象w系具有互補(bǔ)作用，主要體現(xiàn)在大豆分離蛋白與乳清蛋白間可進(jìn)行互相作用并形成“關(guān)鍵簇”，可以促進(jìn)氨基酸的高效利用[3]。大豆蛋白是目前研究最多、且容易獲得的植物蛋白之一，通常用作傳統(tǒng)動(dòng)物蛋白的部分替代品。然而，未經(jīng)處理的大豆蛋白部分或全部替代牛乳蛋白會對食品質(zhì)地和感官特性產(chǎn)生負(fù)面影響。

超聲波技術(shù)被認(rèn)為是提高蛋白質(zhì)溶解性等功能特性的最佳方法[4]，超聲波的空化作用與空穴效應(yīng)能夠破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)，使蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，小分子亞基或肽更多地暴露出來，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的功能特性。乳化性是混合蛋白加工過程中重要的功能指標(biāo)，是決定混合蛋白在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用的重要體現(xiàn)，也是影響混合蛋白產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。提高乳化性有利于改進(jìn)食品組織結(jié)構(gòu)、口感和外觀，可提高食品保存性[5]。研究發(fā)現(xiàn)，采用高強(qiáng)度超聲處理可提高卵清蛋白[6]和小麥面筋蛋白[7]的乳化活性及乳化穩(wěn)定性。CHEN等[8]研究發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度超聲波處理SPI，在400 W時(shí)會明顯提升其乳化活性與乳化穩(wěn)定性。ARZENI等[6]采用高強(qiáng)度超聲處理卵清蛋白，乳液穩(wěn)定性增加，熱聚合變快。ZHANG等[9]采用超聲技術(shù)對花生蛋白進(jìn)行改性，結(jié)果顯示，乳化活性與溶解性明顯增大，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。超聲功率與超聲時(shí)間處理都會影響蛋白的乳化特性，在一定范圍內(nèi)，由于超聲功率的增大，乳化活性與乳化穩(wěn)定性均會提高[10]。目前，關(guān)于超聲處理對蛋白乳化特性及結(jié)構(gòu)的影響已有部分研究，但超聲處理對SPI-WPI混合蛋白體系結(jié)構(gòu)及乳化特性的研究還鮮有報(bào)道。本課題組前期已研究了超聲功率對SPI-WPI混合蛋白結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的影響[11]，本文在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究超聲時(shí)間對混合蛋白結(jié)構(gòu)及乳化特性的影響，分析混合蛋白乳化特性改善的機(jī)理，以期為研究新型高乳化性的雙蛋白食品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白，美國HILMAR公司，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.09%；十二烷基磺酸鈉 (SDS)，Sigma公司；大豆分離蛋白，實(shí)驗(yàn)室自制，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.96%；低分子量蛋白質(zhì)Marker，索萊寶生物科技有限公司；5×蛋白上樣緩沖液，索萊寶生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-3600Plus型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；ULTRA-TURRAX T18 Basic 型高速分散機(jī)，德國 IKA 公司；FD5-series型冷凍干燥機(jī)，美國西盟國際集團(tuán)；JY92-ⅡN型超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司； FTIR-8400S型傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；F-4500型熒光分光光度計(jì)，日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1SPI-WPI混合蛋白制備

制備方法參照QIN等[12]的方法，分別將SPI和WPI溶于去離子水中，質(zhì)量濃度為100 mg/mL，磁力攪拌器于室溫 (20℃)下攪拌2 h，然后將兩種蛋白按體積比1∶1進(jìn)行混合并繼續(xù)用磁力攪拌器攪拌2 h，使其充分溶解。對照組：分別將SPI和WPI溶于去離子水中，使蛋白質(zhì)量濃度為100 mg/mL，在室溫下攪拌4 h，使其充分溶解。4℃靜置12 h。

1.3.2超聲處理

參照HU等[13]的方法，將已制備好的SPI-WPI混合蛋白溶液、SPI與WPI溶液放置于50 mL離心管中。在超聲處理前將盛有蛋白液的離心管放置于裝滿冰的燒杯中，在超聲期間進(jìn)行冰浴處理，使樣品溫度控制在25～35℃之間防止樣品過熱。將超聲處理器的鈦探頭(直徑0.636 cm)深入溶液1～2 cm，設(shè)置超聲功率為300 W，超聲時(shí)間分別為0、15、30、45 min，得到超聲后的樣品。

1.3.3聚丙烯酰胺凝膠電泳

參考LAEMMLI[14]的方法并加以改進(jìn)，配置5%的上層膠和13%的下層膠備用。將蛋白樣品稀釋為5 mg/mL，并與5×SDS上樣緩沖液以體積比4∶1進(jìn)行混合，沸水處理5 min。將冷卻后的蛋白溶液吸取7 μL注入樣孔。初始電壓設(shè)定為90 V，進(jìn)入下層膠時(shí)設(shè)定電壓為120 V。電泳結(jié)束后將凝膠條用考馬斯亮藍(lán)染色液(R250)染色后靜置12 h，之后用脫色液脫色3～4次，采用凝膠成像系統(tǒng)分析電泳條帶。

1.3.4傅里葉紅外光譜(FTIR)測定

將冷凍干燥后的蛋白樣品與溴化鉀按質(zhì)量比為1∶100混合，用研缽磨成細(xì)小粉末，然后將混合后的粉末制成薄片[15]，再用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm-1處作全波段掃描，分辨率為4 cm-1。掃描次數(shù)為 32。

1.3.5紫外掃描

參照MORALES等[16]的方法，將蛋白樣品用pH值7.0的磷酸鹽緩沖溶液 (PBS, 0.01 mol/L)進(jìn)行稀釋，使其質(zhì)量濃度為2 mg/mL，用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行紫外掃描，設(shè)置波長范圍220～400 nm，掃描速率為100 nm/min。試驗(yàn)值取3次掃描的平均值。

1.3.6表面疏水性測定

參照HASKARD等[17]的方法略作修改。用pH值7.0的PBS (0.01 mol/L) 對樣品溶液進(jìn)行稀釋，使其樣品質(zhì)量濃度為4、1、0.25、0.062 5 mg/mL。加入20 μL的ANS (8-苯胺-1-萘磺酸，8 mmol/L，pH 值7.0) 熒光探針，混合后在室溫下避光處理15 min。測定樣品的熒光強(qiáng)度，其中設(shè)定發(fā)射波長為470 nm，激發(fā)波長為390 nm，狹縫寬度5 nm。將測得的熒光強(qiáng)度與蛋白溶液質(zhì)量濃度制圖并分析，其斜率作為蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)。

1.3.7濁度測定

參考MARTINI等[18]的方法，用pH值7.0的PBS (0.01 mol/L) 將樣品稀釋為5 mg/mL，將待測樣品用分光光度計(jì)測定吸光度用以表征樣品濁度，波長為600 nm。每個(gè)樣本測定3次并取平均值。

1.3.8乳化活性及乳化穩(wěn)定性測定

參照 PEARCE等[19]的方法。用pH 值7.0的PBS (0.2 mol/L) 將蛋白樣品稀釋至2 mg/mL，取6 mL蛋白樣品溶液加入2 mL大豆油，用高速分散均質(zhì)器于11 000 r/min攪打1 min后，立即于燒杯底部取樣50 μL，加入到5 mL 0.1%的SDS溶液中，混勻后用分光光度計(jì)測定吸光度，波長為500 nm，以SDS溶液作為空白。樣品室溫放置10 min后再次取樣測定吸光度。其乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)計(jì)算公式為

(1)

(2)

式中EAI——乳化活性指數(shù)，m2/g

ESI——乳化穩(wěn)定性指數(shù)，min

T——常數(shù)，取2.303

N——稀釋倍數(shù)，取100

φ——油相體積分?jǐn)?shù)，取25%

L——比色池光徑,cm

C——乳化液形成前蛋白溶液的濃度，mol/L

A0——乳狀液在0 min的吸光度

A10——乳狀液在10 min的吸光度

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，利用SPSS Statistics 20軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用 Origin 9.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行圖譜處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖譜

圖1為經(jīng)不同超聲時(shí)間處理的SPI、WPI和SPI-WPI的凝膠電泳圖。圖中，泳道M表示標(biāo)準(zhǔn)分子量；泳道1、2、3、4分別為SPI樣品0、15、30、45 min超聲處理；泳道5、6、7、8分別為WPI樣品0、15、30、45 min超聲處理；泳道9、10、11、12分別為SPI-WPI樣品0、15、30、45 min超聲處理。由圖可知，與未處理的蛋白相比，超聲處理后蛋白條帶沒有發(fā)生明顯變化，說明沒有新的蛋白質(zhì)降解片段或蛋白質(zhì)聚集產(chǎn)物出現(xiàn)，超聲處理不會引起蛋白質(zhì)分子量的改變[20]。SPI-WPI混合體系與對照SPI和對照WPI相比在66.2 ku以上有新條帶出現(xiàn)，可能是因?yàn)榛旌系鞍自诔曁幚頃r(shí)產(chǎn)生的熱效應(yīng)促使SPI與WPI之間進(jìn)行相互作用，形成新的蛋白聚集體。

圖1 不同超聲時(shí)間處理下SPI、WPI、SPI-WPI的 SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of SPI, WPI and SPI-WPI under different ultrasonic time

2.2 傅里葉紅外光譜分析

圖2為不同超聲時(shí)間處理后SPI、WPI、SPI-WPI的傅里葉紅外光譜圖。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，氫鍵是穩(wěn)定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要作用力。

表1為擬合后SPI、WPI、SPI-WPI二級結(jié)構(gòu)含量。由表可知，未處理蛋白二級結(jié)構(gòu)中β-折疊含量最高，其次為β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和α-螺旋。隨超聲時(shí)間增加，SPI和WPI二級結(jié)構(gòu)中，β-折疊含量逐漸降低，β-轉(zhuǎn)角含量顯著增加，α-螺旋和無規(guī)則卷曲含量略有增加。SPI-WPI中α-螺旋和β-折疊含量降低，β-轉(zhuǎn)角含量增加，無規(guī)則卷曲含量略有增加。β-折疊含量降低可能是由于超聲引起的空穴效應(yīng)促進(jìn)蛋白質(zhì)的機(jī)械運(yùn)動(dòng)，使分子相互撞擊，促使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集反應(yīng)。STATHOPULOS等[22]也指出蛋白質(zhì)發(fā)生聚集會導(dǎo)致β-折疊含量減少。β-折疊含量還與蛋白質(zhì)的疏水相互作用有關(guān)，其含量降低表明蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)的暴露，疏水性增強(qiáng)[23]。而同作為β結(jié)構(gòu)，β-折疊更易轉(zhuǎn)變?yōu)棣?轉(zhuǎn)角，在超聲處理下β-轉(zhuǎn)角含量增加，也可以說明超聲波處理使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加舒展[24]。此外，經(jīng)超聲處理后SPI-WPI中無規(guī)則卷曲含量增加伴隨著α-螺旋含量的降低，說明超聲處理可以改變WPI和SPI的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并且會促進(jìn)混合蛋白質(zhì)之間的相互作用[25]。

圖2 不同超聲時(shí)間處理對傅里葉紅外光譜的影響Fig.2 Effects of different ultrasonic time processing on FTIR spectra

表1 不同超聲時(shí)間處理下SPI-WPI、SPI和WPI二級結(jié)構(gòu)相對含量Tab.1 Effect of different ultrasonic time processing on the secondary structure analysis of SPI-WPI, SPI and WPI

2.3 紫外光譜分析

超聲處理SPI-WPI、SPI與WPI發(fā)出不同紫外吸收峰的原因是兩種蛋白質(zhì)側(cè)鏈含有不同的酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸殘基[26]。樣品的紫外吸收光譜不同，可推斷蛋白質(zhì)分子三級構(gòu)象發(fā)生改變[27]，進(jìn)而分析氨基酸殘基的改變[28]。

不同超聲時(shí)間處理蛋白體系紫外光譜圖如圖3所示。由圖可知，不同時(shí)間超聲處理后SPI-WPI混合蛋白體系的紫外光譜強(qiáng)度大于SPI和WPI，說明超聲處理對混合蛋白作用效果更明顯，混合體系在30、45 min處理后紫外強(qiáng)度顯著增加，且最大吸收強(qiáng)度略微紅移，表明氨基酸環(huán)境向更加疏水的環(huán)境轉(zhuǎn)移，這可能是因?yàn)榛旌系鞍左w系構(gòu)象發(fā)生了改變，超聲使蛋白結(jié)構(gòu)變得更加舒展。SPI與WPI在超聲處理后，紫外強(qiáng)度略微增加，說明超聲處理使SPI與WPI蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)部分展開，發(fā)色基團(tuán)與芳雜環(huán)疏水基團(tuán)更加暴露。SPI紫外強(qiáng)度變化較小的原因可能是其蛋白顆粒較大，超聲處理后體系易發(fā)生聚集體，會影響發(fā)色基團(tuán)的暴露。混合體系紫外強(qiáng)度的變化說明不同超聲時(shí)間處理有利于混合蛋白體系構(gòu)象發(fā)生變化，引起蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的改變。

圖3 紫外光譜圖Fig.3 Ultraviolet spectrum

2.4 表面疏水性

不同超聲時(shí)間處理對蛋白質(zhì)表面疏水性的影響如圖4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，圖中不同大、小寫字母表示具有顯著性差異(p<0.05)，下同。由圖可知，未處理的SPI-WPI混合體系、SPI與WPI樣品表面疏水性最低。經(jīng)處理后的混合體系和SPI表面疏水性呈先增大后下降的趨勢，SPI-WPI混合體系增加最為顯著，在超聲30 min時(shí)達(dá)到最高，WPI表面疏水性隨著超聲時(shí)間的延長持續(xù)增大。這可能是因?yàn)槲唇?jīng)超聲處理的蛋白中疏水基團(tuán)被包裹在蛋白分子內(nèi)部，導(dǎo)致其與熒光探針的接觸受到抑制[29]。超聲處理產(chǎn)生的空穴效應(yīng)使蛋白氫鍵和分子間作用力裂解，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，聚集的球狀蛋白質(zhì)逐漸解締，蛋白質(zhì)分子進(jìn)一步展開[30]，隱藏在SPI-WPI混合蛋白與SPI蛋白體系內(nèi)部疏水基團(tuán)與發(fā)色基團(tuán)在長時(shí)間超聲處理后更多地暴露出來，蛋白結(jié)構(gòu)變得更加舒展。在較長時(shí)間(45 min)超聲處理后，蛋白體系表面疏水性又降低，可能是因?yàn)殚L時(shí)間超聲處理產(chǎn)生了熱效應(yīng)，在后期冷卻過程中疏水互相作用會造成蛋白質(zhì)疏水聚集，從而表面疏水性指數(shù)減小。

圖4 不同超聲時(shí)間處理對蛋白質(zhì)表面疏水性的影響Fig.4 Effect of different ultrasonic time processing on hydrophobicity of protein surface

2.5 濁度分析

圖5為不同超聲時(shí)間處理對蛋白質(zhì)濁度的影響。隨著超聲時(shí)間的增加，SPI、WPI、SPI-WPI混合體系濁度均呈下降趨勢。未處理樣品的濁度最高，這是由此時(shí)的復(fù)合體系蛋白分布不均衡且顆粒較大導(dǎo)致。SPI和SPI-WPI在0～15 min處理下濁度變化最顯著。這可能是因?yàn)榇藭r(shí)超聲處理復(fù)合體系間蛋白碰撞面大，空穴效應(yīng)使大分子物質(zhì)分解為小分子顆粒，樣品中顆粒大小和顆粒數(shù)目發(fā)生變化，CROMWELL等[31]也認(rèn)為樣品濁度與其溶液中聚集體數(shù)量和大小有關(guān)。超聲45 min時(shí)濁度達(dá)到最小值。SPI-WPI混合體系濁度在超聲處理30～45 min時(shí)間內(nèi)變化不明顯。這可能是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間繼續(xù)延長，體系中懸浮顆粒的粒度尺寸減小，此時(shí)體系的布朗運(yùn)動(dòng)快速增加，蛋白顆粒接觸幾率增大發(fā)生重聚集，從而使顆粒更難減小。濁度也與膠體的大小、濃度和折射率性質(zhì)等高度相關(guān)[32]。WPI濁度變化不顯著，是因?yàn)槿榍宓鞍子泻芎玫姆稚⑿裕伊Ｗ虞^小。

圖5 不同超聲時(shí)間對濁度的影響Fig.5 Effect of different ultrasonic time on turbidity

2.6 乳化活性及乳化穩(wěn)定性分析

圖6 不同超聲時(shí)間對乳化性的影響Fig.6 Effect of different ultrasonic time on emulsification

圖6為不同超聲時(shí)間處理SPI-WPI、SPI、WPI對其乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響。由圖可知，SPI-WPI的乳化活性與乳化穩(wěn)定性隨超聲處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在超聲30 min時(shí)乳化活性指數(shù)達(dá)到最大值(78.39 m2/g)，乳化穩(wěn)定性指數(shù)同時(shí)達(dá)到最大值(17.31 min)。SPI與WPI的乳化活性也有同樣的趨勢，在30 min達(dá)到最大值，乳化活性指數(shù)分別為66.78、77.47 m2/g。乳化活性升高可能是因?yàn)楸砻媸杷栽黾樱缑鎻埩档?，蛋白質(zhì)和油脂之間的相互作用增加[33]。超聲30 min后SPI-WPI、SPI、WPI的乳化活性隨超聲時(shí)間增加逐漸下降，這可能是因?yàn)槌曁幚淼鞍讜r(shí)，顆粒的破碎與重聚集同時(shí)發(fā)生，隨著超聲作用時(shí)間的延長，蛋白之間重聚集現(xiàn)象出現(xiàn)，影響疏水基團(tuán)的暴露，從而導(dǎo)致乳化活性在一定程度上下降[34]。SPI的乳化穩(wěn)定性指數(shù)在15 min時(shí)達(dá)到最大值(12.61 min)。WPI的乳化穩(wěn)定性指數(shù)則在45 min達(dá)到最大值(16.92 min)。超聲處理作用會帶來空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，這種作用力會打破蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)，暴露更多的亞基。SPI-WPI混合體系的乳化活性及乳化穩(wěn)定性略高于對照組，這可能是因?yàn)槌曁幚砗骃PI-WPI混合體系在水中進(jìn)一步伸展，內(nèi)部基團(tuán)暴露，整體結(jié)構(gòu)舒展利于兩種蛋白之間相互作用[35]，同時(shí)增強(qiáng)蛋白的界面性質(zhì)與疏水性質(zhì)，直接導(dǎo)致乳化活性指數(shù)與乳化穩(wěn)定性指數(shù)的升高[36]。

3 結(jié)束語

超聲處理對混合蛋白的分子量無明顯影響，但對二級、三級結(jié)構(gòu)影響顯著。隨超聲處理時(shí)間的增加，SPI-WPI混合體系中α-螺旋和β-折疊含量降低、β-轉(zhuǎn)角含量和無規(guī)則卷曲含量增加，說明超聲引起的空穴效應(yīng)能促進(jìn)蛋白質(zhì)的機(jī)械運(yùn)動(dòng)，使分子相互撞擊，促使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集反應(yīng)，超聲處理改變了WPI和SPI的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，促進(jìn)混合蛋白質(zhì)之間的相互作用。紫外光譜結(jié)果顯示，SPI-WPI紫外最大吸收峰發(fā)生輕微紅移，且紫外光譜強(qiáng)度發(fā)生改變，說明超聲處理改變了蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)。隨著超聲時(shí)間的增加，SPI-WPI混合體系的濁度呈顯著下降趨勢，未處理樣品的濁度最高，這是由此時(shí)的復(fù)合體系蛋白分布不均衡所導(dǎo)致。隨著超聲處理時(shí)間的增加，混合蛋白體系乳化活性指數(shù)與乳化穩(wěn)定性指數(shù)呈現(xiàn)先增加、后下降的趨勢，表面疏水性也有相同變化趨勢。不同超聲時(shí)間處理會改變蛋白結(jié)構(gòu)，蛋白體系內(nèi)部疏水基團(tuán)與發(fā)色基團(tuán)更多暴露，蛋白結(jié)構(gòu)變得更加舒展。表面疏水性增加，增大了蛋白質(zhì)和油脂之間的相互作用，有利于提高混合蛋白體系的乳化活性。