聚乙二醇對大豆分離蛋白美拉德反應和功能特性的影響

滿朝新 譚兆倫 胡 淼 李 楊 謝鳳英 齊寶坤

(東北農業大學食品學院， 哈爾濱 150030)

0 引言

大豆分離蛋白(Soy protein isolate, SPI)通過堿溶-酸沉淀的方法從脫脂大豆粉中提取，根據離心后不同的沉降系數，SPI主要由兩種球蛋白組成，即伴大豆球蛋白(7S)和大豆球蛋白(11S)[1]。SPI的親水親油特性使其具有良好的油-水界面吸附能力，并通過厚保護層降低界面張力，因此可作為穩定乳液的有效乳化劑[2]。但由于其結構限制，SPI的乳化性能不理想。

美拉德反應被證實是一種改善蛋白功能特性的有效方法，例如乳化性等[3]。目前，應用于蛋白改性的美拉德反應多為干熱法，即在受控溫度及濕度下制備蛋白-多糖復合物[4-6]，這種方法通常需要數天甚至更長的時間，而且反應不受控制，容易產生過度褐變現象，所以不適用于工廠加工生產。濕法美拉德反應是在高溫下制備蛋白-多糖復合物[7]，這種方法加工時間較短，且能有效將反應控制在初期階段。但這種方法缺點是：在高溫環境下，蛋白大量聚集并抑制美拉德反應，使得美拉德反應程度較低[8]。

為了解決這個問題，一些研究者引入生命科學中的大分子擁擠效應。當溶液中存在高濃度大分子物質時，反應遵從排除體積理論，促進反應向總體積減少的方向移動，即結合方向移動[9-10]。且在大分子擁擠環境下，高濃度大分子物質能夠極大地降低蛋白聚集的可能性[11-12]。血紅蛋白、卵清蛋白、牛血清蛋白等天然蛋白與多糖都是優秀的擁擠劑，可用于模擬細胞擁擠環境[13]，但這些物質易與SPI或葡聚糖(Dextran，D)發生反應，影響美拉德反應的進行，故需選擇一種不與SPI及D發生反應的無關生物大分子物質。

聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)是一種無毒、不與SPI和D發生反應的無關生物大分子物質，通過控制溶液中PEG的含量，可以避免不同底物濃度對溶液反應速率的影響,并獲得不同擁擠程度的溶液環境。文獻[14]研究了PEG對乳清分離蛋白超聲美拉德反應的影響，發現PEG能夠有效提高產物的接枝度。

本文通過濕法制作SPI-D復合物，通過測定接枝度、電泳、粒徑、紅外光譜、表面疏水性、乳化活性等指標，探究不同PEG質量濃度對SPI美拉德反應的影響，并研究其對SPI改性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，東北農業大學大豆研究所；氫氧化鈉、氯化鈉，天津市光復精細化工研究所；透析袋(8～14 ku)、葡聚糖(10 ku)，北京索萊寶科技有限公司；鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、PEG(6 ku)，北京新光化工試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AL204型分析天平，梅勒特-托利多儀器(上海)有限公司；CL-2 型恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；落地式凍干機，上海匯分電子科技有限公司；LGR20-W型臺式高速冷凍離心機，北京京立離心機有限公司；Delta320 型pH計，梅特勒-托利多儀器公司；MAGNA-IR560型傅里葉變換紅外光譜儀，美國NICOLET公司；F-4500型熒光分光光度計，日本HITACHI公司； UV-5100 型高性能紫外可見分光光度計，上海奧析科學儀器；Phomo型酶標儀，鄭州安圖實驗儀器有限公司；SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)儀, 北京君意東方電泳設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1SPI制備

SPI的制備根據文獻[15]的方法,將大豆粉碎后過60目篩后用正己烷脫脂。以液料比10 mL/g將脫脂豆粕與水混合,用NaOH溶液調節pH值至8.0,20℃下攪拌1 h,然后4℃下8 000g離心20 min,取上清液,用HCl溶液調節上清液pH值為4.5,靜置后4℃下6 000g離心20 min,取沉淀,水洗3次,然后溶解于水中形成蛋白溶液,用NaOH溶液調節pH值至7.0, 4℃下8 000g離心20 min, 除去少量不溶物, 將蛋白溶液冷凍干燥得SPI。

1.3.2SPI-D美拉德產物制備

根據文獻[16]的方法，將SPI、D按照1∶2的質量比溶于去離子水中，SPI質量濃度為0.02 g/mL，D質量濃度為0.04 g/mL，然后分別添加0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/mL的PEG，通過添加0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH溶液將溶液pH值調至7.0，并在4℃下攪拌后靜置12 h使蛋白完全水合后，將其在90℃水浴下分別反應3 h，然后10 000g離心20 min，將得到的上清液用蒸餾水透析24 h后冷凍干燥，然后采用BCA(一種能與銅離子特異性結合的鈉鹽)法測量蛋白濃度，取未加熱的SPI-D混合物做對比。

1.3.3接枝度測定

根據文獻[17]采用鄰苯二甲醛(OPA)法測定游離氨基含量從而計算SPI的接枝度。取40 mg OPA溶于1 mL甲醇中，加入0.1 mol/L 25 mL硼砂溶液、2.5 mL體積分數為20%的十二烷基磺酸鈉溶液和100 μL β-琉基乙醇，并用去離子水定容至50 mL，即得OPA試劑。準確稱取樣品，將其配制成蛋白質質量濃度為0.5 mg/mL的溶液，取樣品溶液400 μL，加入8 mL OPA試劑，混合均勻后置于37℃水浴30 min，取反應后的溶液在340 nm下測定吸光度。計算樣品中游離氨基的含量，并計算接枝度，接枝度G的計算公式為

(1)

式中A1——糖基化反應前SPI的游離氨基質量濃度

A2——糖基化反應后SPI-D接枝物的游離氨基質量濃度

1.3.4SDS-PAGE實驗

根據文獻[18]的方法進行SDS-PAGE實驗。分別配置12%的分離膠與5%的濃縮膠，將5%的2-巰基乙醇(2-ME)加入到樣品緩沖液中。將樣品和緩沖液的混合物在沸水中加熱3 min，用于電泳運行的緩沖液是0.025 mol/L Tris-HCl、0.192 mol/L甘氨酸和0.1%SDS，上樣量為10 μL，之后凝膠采用0.1%考馬斯亮藍(R-250)染色液(含體積分數45%的甲醇和體積分數10%的冰乙酸)染色30 min，并用脫色液洗滌脫色后分析。

1.3.5粒徑分析

根據文獻[19]使用Mastersizer 2000型粒徑電位儀進行粒徑的測量。在裝入PCS8501型比色杯之前，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7)將樣品稀釋至0.1%。所有測量均在25℃下進行3次。對于分散相使用1.450的折射率，對于連續相(10 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH值7.4)使用1.331的折射率。

1.3.6紅外光譜分析

根據文獻[20]將超聲處理后的SPI溶液進行凍干，凍干后的樣品置于干燥器中用P2O5充分干燥，取樣品1.5 mg，與200 mg溴化鉀研磨混勻后壓片進行紅外光譜測定。在實驗過程中，為了減少蒸汽的干擾，用干燥的N2持續注入測量室。測定時波數范圍為400～4 000 cm-1，掃描次數為64次，分辨率4 cm-1，得到的紅外吸收曲線采用Peak fitting軟件和高斯曲線擬合，分析擁擠環境下SPI二級結構含量的變化。

1.3.7表面疏水性測定

根據文獻[21]方法略有修改，使用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)制備5 mL不同質量濃度蛋白質溶液(0.05、0.1、0.15、0.20、0.25 mg/mL)的等分試樣。然后向蛋白質溶液中加入20 μL 1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)溶液(8.0 mmol/L，pH值7.0)，充分混合并在黑暗環境中20℃下靜置15 min后，測量樣品的熒光強度。激發波長設定為300 nm，發射波長為450 nm，狹縫寬度為5 nm。將測量的熒光強度對蛋白質溶液質量濃度制圖，并選擇具有良好線性關系的回歸線斜率作為蛋白質表面疏水性指數H0。

1.3.8游離巰基含量測定

游離巰基含量參照文獻[22]測定。將1 mL蛋白質質量濃度1 mg/mL的樣品溶液溶于5 mL Tris-Gly緩沖溶液(0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，4 mmol/L乙二胺四乙酸，8 mol/L尿素，pH值8.0)。然后，將20 μL 2-硝基苯甲酸(DTNB)試劑加入上述混合溶液中，并通過渦旋混合器快速混合。最后，將混合物在室溫下反應15 min。在412 nm的波長下測量吸光度。不含DTNB的混合溶液用作對照。

游離巰基質量摩爾濃度O計算公式為

O=73.53A412D/E

(2)

式中A412——412 nm處的吸光度

E——固體質量濃度，mg/mL

D——稀釋因子

1.3.9溶解度測定

參照文獻[23]的方法稍作修改測定SPI-D混合物溶解性，取凍干粉末溶解于蒸餾水中，配制成質量濃度約為10 mg/mL的蛋白質溶液，攪拌1 h使樣品溶解，靜置2 min后，將靜置后的上層溶液倒入離心管中離心15 min (10 000g)。取上清液2 μL稀釋10倍，采用BCA法測定蛋白質含量。以牛清蛋白為標準物，蛋白質溶解度為上清液中蛋白質量占樣品中總的蛋白質量百分比。

1.3.10乳化活性及乳化穩定性測定

樣品乳化活性及乳化穩定性的測定參照文獻[24]。在0 min和10 min時從乳液樣品底部分別取樣50 μL，經SDS稀釋200倍，充分混合后在500 nm處測定吸光度，以SDS作空白對照。乳化活性指數和乳化穩定性指數分別表示為

(3)

(4)

式中E1——乳化活性指數，m2/g

E2——乳化穩定性指數，%

T——活性常數，取2.303

N——稀釋倍數，取200

θ——油相體積分數，取20%

L——比色杯厚度，取1 cm

C——乳化液形成前蛋白質水溶液中蛋白質質量濃度，取2 mg/mL

A0、A10——乳狀液在0、10 min的吸光度

1.4 數據處理

本實驗數據均為3個平行樣的平均值，結果采用SPSS 22.0分析軟件和Origin 8.0軟件進行處理，采用ANOVA對數據進行差異顯著性分析(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 接枝度

蛋白中的游離氨基與還原糖中的羰基通過共價連接形成席夫堿[25]，通常用游離氨基結合程度即接枝度評估美拉德反應的程度。如圖1所示，隨著PEG質量濃度的提高，蛋白糖化程度不斷加深，在PEG質量濃度提高到0.06 g/mL以上時，糖化增速放緩。在反應過程中，美拉德反應的底物含量沒有變化，糖化程度提高可能是由于在加熱的液體環境下蛋白部分解離成亞基，為D提供了更多的結合位點[26]。只提高了無關大分子物質PEG的含量，糖化程度卻能逐漸提高，證明擁擠環境能促進大豆蛋白糖化，而這與文獻[16]研究一致。

圖1 不同PEG質量濃度下SPI-D復合物的接枝度Fig.1 Glycation degree of SPI-D complexes under different PEG concentrations

2.2 SDS-PAGE

為了進一步證實大豆蛋白與D的共價復合及擁擠環境對共價復合的影響進行了SDS-PAGE實驗，如圖2所示，在凝膠頂部出現條帶，這種現象的產生可能是有大分子的美拉德結合物產生，較高分子量的蛋白的產生被認為是美拉德反應形成復合物的重要表現[24,27]。在PEG質量濃度從0增加到0.10 g/mL時，凝膠頂部條帶強度逐漸增加，證明擁擠環境促進大豆蛋白糖化。在加熱的大豆蛋白的凝膠頂部觀察到微弱的擴散帶(對比)?？赡苁羌訜徇^程中形成異構肽或二硫鍵交聯導致大分子蛋白質的出現[28]。圖2還顯示，在美拉德反應下，樣品泳道所有條帶強度均有減弱，這表明這些亞基都參與了與D的美拉德反應，且有部分亞基分解為更小的亞基或多肽。隨著PEG質量濃度的不斷提升，凝膠條帶強度逐漸減弱，證明有更多的亞基參與美拉德反應，從側面說明擁擠環境可以促進大豆蛋白糖化。

圖2 不同PEG質量濃度下SPI-D復合物的 SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE of SPI-D complexes under different PEG concentrations

2.3 粒徑

動態光散射是基于物質在溶液中的布朗運動測定其粒子直徑，SPI的糖基化改性程度與聚集程度可以通過粒徑及其分布直觀表達。原始蛋白平均粒徑最大，然后隨著糖化程度的逐漸加深，產物的平均粒徑越來越小。原因是隨著糖化程度的逐漸加深，蛋白的結構被打開，高度有序的結構轉變為隨機結構[16]，降低了蛋白的聚集；而隨著PEG質量濃度逐漸升高，美拉德反應下蛋白亞基分解為更小的亞基或多肽，這些都降低了SPI的平均粒徑，使復合物具有更好的溶解性。

2.4 紅外光譜分析

紅外光譜分析能夠有效研究美拉德反應，因為存在易于識別的中紅外光譜區域，而且其中碳水化合物的光譜區域與蛋白質不會顯著重疊[29]。

圖3 不同PEG質量濃度下SPI-D復合物的FT-IR光譜Fig.3 FT-IR spectra of SPI-D complexes under different PEG concentrations

復合物的紅外圖譜如圖3所示，SPI和D之間的美拉德反應會造成氨基基團的損失，使得部分關于氨基基團的吸收峰減少；而另一方面，新的吸收峰的出現歸因于美拉德反應產物。在3 000～3 500 cm-1范圍內觀察到的吸收帶可歸因于游離和結合的O—H和N—H基團，它們能夠與蛋白質中肽鍵的羰基形成氫鍵[30]，而隨著PEG含量的不斷增加，吸收帶逐漸消失。1 654 cm-1處的C—O拉伸(酰胺I)是SPI的主要吸收峰，美拉德反應物在1 654 cm-1處的峰值低于天然SPI，表明美拉德反應消耗了部分基團;糖類通過共價鍵與SPI 連接，2 885 cm-1處的吸收峰可能與糖環中CH的伸縮振動有關[31]，隨著PEG含量的增加，糖化程度逐漸加深，吸收峰明顯增大。950～1 050 cm-1區域的變化可能來自蛋白質的側鏈振動，表明蛋白質結構的改變[32]。與天然SPI比較，復合物在840 cm-1處的吸收峰明顯增大。證實了多糖的α-糖苷鍵的存在，且隨著PEG質量濃度的提高，吸收峰越來越明顯，證明有更多SPI-D復合物產生，擁擠環境能夠有效增加SPI接枝度。

通過PeakFit 4.12將光譜中1 600～1 700 cm-1段進行曲線擬合，獲得每個二級結構的相對含量，結果如表1所示，α-螺旋與β-折疊的含量均有不同程度下降，而無規則卷曲的含量則是逐漸增加。其中α-螺旋是一種縫隙較少的緊密結構，主要由多肽間的氫鍵維持[24]，蛋白變性勢必會破壞多肽間氫鍵，使得α-螺旋含量降低，且變性程度越大，α-螺旋含量越低。而β-折疊含量降低，無規則卷曲含量逐漸增高，說明了蛋白二級結構的改變。而隨著有序結構的不斷減少，無序結構逐漸增多，說明越來越多的SPI與D共價結合，這與前文接枝度及電泳結果一致，證明擁擠環境能夠有效增加SPI接枝度。

表1 不同PEG質量濃度下SPI-D復合物的二級結構相對含量Tab.1 Relative content of the secondary structure of SPI-D complex under different PEG concentrations %

2.5 表面疏水性

圖4 不同PEG質量濃度下SPI-D復合物的表面疏 水性和游離巰基含量Fig.4 Surface hydrophobicity and free sulfhydryl content of SPI-D complexes under different PEG concentrations

表面疏水性指數H0被認為是暴露在蛋白質分子表面上的疏水基團的數量，它可以反映蛋白質的構象變化,且與蛋白質的功能性質密切相關[33]。如圖4(不同字母表示表面疏水性差異顯著)所示。文獻[34]研究表明，在加熱條件下，SPI的表面疏水性急劇上升，而隨著糖化程度不斷加深，SPI的疏水性呈現下降的趨勢。上升的原因可能是加熱處理后會有更多的疏水基團暴露在蛋白質分子表面，下降的原因可能是糖基化修飾能夠部分屏蔽疏水基團。圖4中隨著糖化程度的加深，SPI的表面疏水性卻呈現下降趨勢。下降的原因可能是SPI高度糖化，進一步打開蛋白分子，使內部緊密球狀區域的疏水基團也暴露出來，過多的疏水基團通過疏水相互作用再聚合[35]，使得疏水性降低。這些結果表明，由糖化引起的SPI二級結構不同程度的改變，使得樣品的表面疏水性不同程度的減小。

2.6 游離巰基

巰基基團和二硫鍵顯著影響食物蛋白質的功能特性，尤其是凝膠化中的網絡形成[36]。如圖4所示，隨著無關生物大分子PEG含量的提高，美拉德產物中的游離巰基含量先上升后下降。研究表明，有兩個情況能夠導致蛋白質中的游離巰基含量發生變化，一是外部作用導致蛋白分子展開，暴露其中的原始巰基；二是蛋白亞基的解離，二硫鍵斷裂產生新的游離巰基[37]。初期，隨著PEG含量的上升，游離巰基含量在增加。大豆蛋白中含有一定的二硫鍵，大豆蛋白在溶液中加熱，使得部分蛋白解離成亞基，二硫鍵斷裂，從而釋放更多的巰基[18]。但隨著PEG含量逐漸上升，游離巰基含量卻不斷下降，原因可能是隨著糖化程度的進一步提高，過多的游離巰基重排形成新的二硫鍵[26]；故隨著PEG質量濃度的提高，擁擠環境能加速蛋白中的二硫鍵斷裂生成更多的游離巰基，表面擁擠環境能促進蛋白分解成亞基，促進糖化。

2.7 溶解度

溶解度是表現蛋白的重要指標，會直接影響蛋白的部分功能性質如乳化性等，而糖化能有效提高蛋白的溶解性。隨著PEG質量濃度的不斷提升，復合物溶解度總體有所提高，但當PEG質量濃度為0.02、0.08 g/mL時，溶解度較低。美拉德反應向蛋白中引入親水基團可以增加復合物的空間穩定性[38]，進而增加復合物的溶解度。隨著美拉德反應的逐漸加深，復合物的溶解度不斷提高。當PEG質量濃度為0.02 g/mL時，促進糖化效果不明顯，粒子直徑仍然較大，影響復合物溶解，故溶解性較低；當PEG質量濃度為0.08 g/mL時，溶解度降低的原因可能是擁擠過度，影響部分SPI處于水合狀態，故溶解性低，而當PEG質量濃度為0.10 g/mL時，水合不完全的蛋白沉淀，溶液中只余下糖化復合物，故其溶解度高。

2.8 乳化活性及乳化穩定性

糖化蛋白質最顯著的特征之一就是能有效改善其乳化性能。因此，研究了糖化對SPI乳化性質的影響，結果如圖5(圖中相同參數不同字母表示差異顯著)所示。隨著PEG質量濃度的增加，SPI-D復合物的乳化活性呈現不斷增加的趨勢,但當PEG質量濃度為0.02、0.08 g/mL時，乳化活性出現異常下降。上升的原因是糖與蛋白質的共價結合可以在油滴周圍形成大分子穩定層，并通過空間排斥使其穩定，防止其絮凝和聚結[39]。此外，α-螺旋等有序結構減少，無規則卷曲等無序結構增加也能提高蛋白的乳化性能[40]；當PEG質量濃度為0.02、0.08 g/mL時，復合物溶液渾濁，溶解性較差，導致復合物較少的吸附到油水界面上[41]，故導致乳化活性異常下降。

圖5 不同PEG質量濃度下SPI-D復合物的乳化 活性及穩定性Fig.5 Emulsification activity and stability of SPI-D complexes under different PEG concentrations

如圖5所示，隨著糖化程度的不斷提高，樣品的乳化穩定性總體有較大提高。這是由于D和大豆蛋白之間的共價結合，乳液粘度增強，凝膠網絡改善，因此可以提高乳化穩定性[42]。當PEG質量濃度為0.02、0.08 g/mL時，復合物溶液渾濁，溶解性比其他質量濃度較差，難以有效延緩乳析，故乳化穩定性較差。

3 結束語

通過添加PEG參與SPI-D美拉德反應，研究擁擠環境對美拉德反應產物的表征及結構影響，結果表明：擁擠環境能極大地促進大豆蛋白糖化程度，同時提高表面疏水性、乳化活性及乳化穩定性；PEG參與美拉德反應使得SPI-D復合物表現出更好的平均粒徑，比未添加PEG的SPI-D溶液分散性更好；擁擠環境下的美拉德反應改變SPI二級結構，α-螺旋等結構減少，無規則卷曲增加，此時SPI有序構象的組成、柔性結構的展開影響蛋白質整體構象的柔韌性，更易與D形成功能特性較好的復合物。結果表明在SPI與D美拉德反應中引入無關大分子PEG是一種提高糖化程度的有效方法。