UHPLC法測定不同產地雷公藤飲片中雷公藤甲素和紅素的含量*

葛丹丹，高家榮，鮑學梅，楊滿琴，徐 倩，蘇 毅

(1 安徽中醫藥大學第二附屬醫院，安徽 合肥 230061；2 安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230061；3 安徽中醫藥大學第二附屬醫院，安徽 合肥 230061)

藥用雷公藤飲片系衛矛科植物雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)的干燥根皮。性：苦，有大毒。其主要功效有活血通絡、祛風除濕、消腫定痛等[1]。現代研究表明雷公藤在治療風濕及類風濕性關節炎、抗腫瘤、糖尿病性腎病的腎臟保護[2-4]等方面具有確切療效。雷公藤甲素與雷公藤紅素是雷公藤有效成分。雷公藤甲素可通過抑制糖尿病大鼠腎組織RANTES的過度表達，從而改善腎間質的纖維化和腎小球功能[5]；亦可誘導急性T淋巴細胞性白血病的細胞凋亡而治療白血病[6]；同時，雷公藤甲素可抑制小鼠乳腺癌細胞4T1的增殖，此抗增殖作用與其降低ERα、ERβ的磷酸化密切相關[7]。雷公藤紅素對腦缺血后血管和細胞重生具有保護作用[8]；也可治療諸如卵巢癌[9]等腫瘤。對高糖誘導的大鼠糖尿病心肌病的心肌H9C2細胞具有抑制作用從而發揮對心肌細胞的保護作用[10]。目前，雷公藤飲片在諸多方面已經得到非常廣泛的應用，但在市場上不同來源、產地、加工及儲存方法等的差異導致飲片的質量亦有所不同，進而影響其臨床療效。因此，本研究運用UHPLC技術對不同產地雷公藤飲片中雷公藤甲素和雷公藤紅素的含量進行測定，以期為進一步研究提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

1290 InfinityⅡUHPLC 色譜儀，Agilent Technologies；DK-S24電熱恒溫水浴鍋，上海三發科學儀器有限公司；BP211D型十萬分之一天平，德國Sartorius公司；XFB-200 高速中藥粉碎機，中國吉首市中州制藥機械廠。

1.2 試 藥

雷公藤甲素對照品(批號：111567，純度為99.8%)，中國食品藥品檢定研究院；雷公藤紅素對照品(批號：111946，純度為97.0%)，中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，水為超純水，其他均為分析純。

雷公藤飲片分別購自湖北、廣東等地，經安徽中醫藥大學第二附屬醫院鮑學梅主任鑒定為衛矛科雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)的根。來源見表1。

表1 雷公藤飲片來源

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm ×100 nm，1.7 μm)；流動相：乙腈(B)-0.1%磷酸水(A)，梯度洗脫：0～2 min，95% B；2～12 min，88%B；12～17 min，85%B；17～26 min，76%B；26～44 min，40%B；44～49 min，20%B；49～55 min，5%B；55～56 min，95%B。流速：0.5 mL/min；進樣量：5 μL；檢測波長：210 nm；柱溫：25 ℃。在此色譜條件下，雷公藤甲素與雷公藤紅素與其他色譜峰均可達到有效分離，雷公藤甲素的理論塔板數為58328，雷公藤紅素的理論塔板數為609362，均符合要求。雷公藤甲素與雷公藤紅素的分離度>1.5，符合《中國藥典》中的規定。空白溶劑對含量測定無干擾，如圖1所示。其中，雷公藤甲素為1號峰、雷公藤紅素為2號峰。

圖1 UHPLC色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取雷公藤甲素及雷公藤紅素對照品適量置于10 mL的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別制得質量濃度為0.115 mg/mL和0.137 mg/mL的雷公藤甲素與雷公藤紅素對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取各產地雷公藤飲片，干燥后打成粉(過三號篩)。取藥材粉末10 g至錐形瓶中，加甲醇-乙腈(1∶2，V/V)150 mL水浴回流提取2 h，再次稱定質量，補足減失的質量。過濾，取濾液濃縮近干。加甲醇20 mL使溶解，過SPE中性氧化鋁柱，用二氯甲烷-甲醇(7∶3)50 mL洗脫，收集洗脫液濃縮至干，用甲醇溶解并稀釋定容至10 mL容量瓶中，作為供試品溶液。進樣前過0.22 μm微孔濾膜。

2.3 線性關系考察

精密吸取配制好的對照品儲備液適量，將其稀釋到一定濃度，用甲醇配制7個濃度梯度的對照品溶液，按上述“2.1項”色譜條件進樣測定，記錄色譜峰面積，以對照品濃度為橫坐標(X)，色譜峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸分析，得雷公藤甲素的回歸方程為：Y=807211X-40938(R2=0.9994)；雷公藤紅素的回歸方程為：Y=939678X-54915(R2=0.9991)。雷公藤甲素與雷公藤紅素的線性范圍分別為0.23～115 μg/mL、0.137～27.4 μg/mL。

2.4 精密度試驗

分別精密吸取上述對照品溶液，照“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，測定色譜峰面積，結果雷公藤甲素的RSD為1.67%，雷公藤紅素的RSD為2.53%。符合精密度要求，表明儀器精密度良好。

2.5 重復性試驗

稱取湖北產雷公藤藥材粉末6份，每份10 g，按上述供試品溶液制備方法制備，按“2.1項”下色譜條件進行進樣測定，測定色譜峰面積并計算各樣品含量。結果，雷公藤甲素含量的RSD為1.34%；雷公藤紅素含量的RSD為2.26%。表明本方法的重復性良好。

2.6 穩定性試驗

精密稱取湖北產同一批雷公藤飲片，按上述“2.2”項下條件制備供試品，分別于0、2、4、8、12、24 h后，照“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。計算雷公藤甲素和雷公藤紅素RSD分別為2.15%和3.24%，表明供試品溶液在24 h內保持穩定。

2.7 加樣回收率試驗

取湖北產雷公藤藥材粉末6份，每份10 g，精密稱定，分別精確加入與雷公藤藥材含量等量的雷公藤甲素對照品0.5130 mg和雷公藤紅素對照品0.5850 mg，按上述“2.2”項下條件制備供試品溶液，再按上述“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算平均加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果(n=6)

2.8 樣品含量測定

分別取湖北、福建、云南、廣東四個產地雷公藤藥材粉末各3份，每份約10 g，照上述供試品溶液制備方法制備供試品，按“2.1”項下條件進樣測定，計算含量。結果見表3。

表3 不同產地雷公藤藥材中雷公藤甲素和雷公藤紅素的含量

3 結 論

3.1 實驗條件的優化

本實驗對甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲醇-乙腈(1∶1)等不同提取溶劑及水液回流、超聲等提取方法，提取時間，提取次數等進行了考察，最終選擇甲醇-乙腈(1∶2)作為提取溶劑，提取時間2 h。由于雷公藤飲片中所含化學成分非常復雜且雷公藤甲素和雷公藤紅素的含量相對較少，因此在樣品處理過程中對其進行分離、純化和富集。在參考沈秋林等[11]對雷公藤甲素提取方法的基礎上考察了中性氧化鋁柱與硅膠柱對分離的影響后發現使用硅膠柱雷公藤甲素與紅素的分離效率低。因此，最終選擇使用中性氧化鋁柱對樣品進行分離與富集。在洗脫過程中，二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇(10∶1)、二氯甲烷-甲醇(9∶1)等進行洗脫，洗脫速度慢，最終使用了二氯甲烷-甲醇(7∶3)作為洗脫液，洗脫速度快。

3.2 不同產地樣品含量分析

對福建等四個產地的雷公藤飲片進行了含量測定后發現，不同產地的飲片中雷公藤甲素和雷公藤紅素的含量差別較大，且同一產地的飲片中雷公藤甲素和紅素含量亦存在明顯差異。由實驗結果可知，雷公藤甲素在云南和湖北產的雷公藤飲片中含量較高，而福建、廣東產的飲片含量較低。雷公藤紅素則在湖北、廣東產的飲片中含量較高，而在云南和福建產的飲片則含量低。在同一產地飲片中，云南產飲片中雷公藤甲素和紅素含量差異最為顯著。

本研究通過對雷公藤甲素和雷公藤紅素兩種物質進行含量測定，發現市售不同產地的雷公藤飲片的質量存在差異。然而，由于中藥雷公藤所含物質復雜[12-14]且本實驗所采集的雷公藤飲片的產地有限等問題，因此，需通過進一步研究來綜合評價各產地雷公藤飲片的質量。