響應面法優化超聲輔助提取金線蓮總黃酮工藝研究*

湯須崇，劉希敏，盧紹基，鄧愛華，牛文靜

(1 華僑大學化工學院，福建 廈門 361021；2 廈門塔斯曼生物工程有限公司，福建 廈門 361027；3 湖南文理學院生命與環境科學學院，湖南 常德 415000)

金線蓮(Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl)屬于蘭科開唇蘭屬植物，又名金線絨、金石松、金線草、鳥人參、金蠶等，是我國一種珍貴的傳統中藥材，以全草入藥，味甘、性平[1-2]。藥理研究發現，金線蓮具有多種藥理活性可用于高血壓、糖尿病、心臟病、腎炎、腫瘤等的治療[3]。金線蓮富含黃酮類化合物、多糖、生物堿、揮發油、甾體化合物、氨基酸等多種植物活性成分[4]。金線蓮臨床藥理價值是基于其中主要活性物質多糖類、黃酮類及黃酮苷元，同時黃酮類和多糖類化合物也是檢測天然產物活性成分的重要指標[5]。黃酮類化合物又稱黃酮體、類黃酮等，目前金線蓮中已被發現的黃酮類有30多種，主要以槲皮素、山奈酚、異鼠李糖及其衍生物為主[6-7]。金線蓮總黃酮具有多種藥理作用，具有降血糖、降血壓、抗氧化、保肝、抗炎癥和鎮痛等的藥用功效。李明等[8]發現黃酮類化合物可改善腸道菌群治療炎癥腸病；白鷺等[9]研究發現黃酮類可通過抗炎等作用對血管內皮細胞損傷起保護作用；李鴻等[10]實驗發現該類化合物可起到抗動脈硬化作用；王虹等[11]發現黃酮類化合物能起到調節免疫信號通路治療相關免疫疾病的作用；研究還顯示黃酮類還具有抗乳腺癌[12]，抗肝癌[13]，抗肺癌[14]等作用。近年來金線蓮的研究主要集中在藥理活性及多糖提取與應用，而有關金線蓮總黃酮的研究相對較少但其又具有巨大的利用價值，值得對其提取工藝進行優化，提高金線蓮中總黃酮得率，為金線蓮中總黃酮深入研究提供前提條件。

目前金線蓮總黃酮的提取方法主要有：醇提、水提、堿提、系統溶劑提取以及超聲波、微波、酶、超臨界萃取等[15-22]。超聲波提取是以溶液為介質發出一定頻率的超聲波產生空化作用和機械效應，這種作用可使待提取中藥材細胞壁被破壞，提取物溶出到提取液中。超聲條件溫和不會破壞有效成分結構，且操作簡便，能耗低提取效率高[23]。本研究采用超聲波輔助溶劑法提取技術，運用Box-Behnken中心組合設計以提取溫度、超聲時間、料液比以及乙醇濃度為影響因素的四因素三水平實驗模型，建立回歸方程，以響應面分析法(RSM)[24]對試驗結果進行分析，對金線蓮總黃酮的提取工藝進行優化，為進一步研究其藥理活性、作用機制提供一定的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金線蓮，廈門塔斯曼生物工程有限公司；蘆丁標準品，中國藥品生物制品檢定所；氫氧化鈉，上海國藥集團化學試劑有限公司；亞硝酸鈉，上海國藥集團化學試劑有限公司；硝酸鋁，上海國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇，上海國藥集團化學試劑有限公司。其余試劑均為藥用級。

1.2 儀器與設備

600Y老本行多功能粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司；DHG-9075A鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；AR1502CN電子分析天平，上海奧豪斯儀器有限公司；KQ5200E超聲波清洗儀(功率300 W)，昆山市超聲儀器有限公司；UV-8000紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；Hei-VAP Precision旋轉蒸發儀，德國海道夫公司；DK-S22電熱恒溫水浴鍋，上海精宏儀器有限公司；SHB-IIIT循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司。

2 方 法

2.1 金線蓮總黃酮的提取工藝

稱取5 g的金線蓮干燥樣品，加入一定量的乙醇溶液，在一定的溫度和功率超聲處理一定時間，過濾，續濾液測定其總黃酮含量。

2.2 總黃酮含量的測定[25]

2.2.1 標準曲線的繪制

精密稱取干燥至恒重的蘆丁標準品5.0 mg，用60%乙醇配置成0.1 mg/mL蘆丁標準溶液。精密移取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL蘆丁標準溶液置于10 mL容量瓶中，加入2 mL 60%乙醇溶液再加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，靜置6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，靜置6 min；加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，用60%乙醇定容至10.0 mL，靜置15 min。以蘆丁含量(mg/g)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線如圖1所示，得到回歸方程為Y=1.4729X+0.0033(R2=0.9989)。

圖1 蘆丁含量標準曲線

2.2.2 金線蓮黃酮得率的計算

準確吸取1.0 mL待測樣品于10 mL比色管中，加入60%乙醇溶液2 mL，再加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，靜置6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，靜置6 min；加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，用60%乙醇定至10.0 mL，靜置15 min，以不加蘆丁標準品的溶液作為空白對照，于510 nm處測定其吸光度。按下式計算樣品中總黃酮的提取量：

總黃酮提取量=CD/m

式中，C為回歸計算得到的總黃酮含量，mg/mL；D為稀釋倍數；m為稱取金線蓮樣品的質量，g。

2.3 單因素實驗

根據文獻報道和預實驗結果，分別考察溫度、超聲時間、料液比以及乙醇濃度等4個單因素對金線蓮總黃酮提取量的影響。

2.3.1 溫度對總黃酮提取量的影響

稱取干燥金線蓮樣品，加入體積分數為70%的乙醇溶液，料液比為(g∶mL)1∶40，超聲時間50 min，分別于溫度20、30、40、50、60、70 ℃進行超聲提取，測定提取液中總黃酮提取量。

2.3.2 超聲時間對總黃酮提取量的影響

稱取干燥金線蓮樣品，加入體積分數為70%的乙醇溶液，料液比為(g∶mL)1∶40，溫度設定50 ℃，分別提取20、40、60、80、100、120 min，測定提取液中總黃酮提取量。

2.3.3 料液比對總黃酮提取量的影響

稱取干燥金線蓮樣品，加入體積分數為70%的乙醇溶液，溫度設定50 ℃，超聲時間50 min，分別以料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45進行超聲提取，測定提取液中總黃酮提取量。

2.3.4 乙醇濃度對總黃酮提取量的影響

稱取干燥金線蓮樣品，料液比為(g∶mL)1∶40，溫度設定50 ℃，超聲時間50 min，分別以乙醇濃度0、20%、40%、60%、80%、95%進行超聲提取，測定提取液中總黃酮提取量。

2.4 響應面試驗設計

按照Box-Behnken 試驗設計原理，在根據單因素考察實驗選取溫度(A/℃)、超聲時間(B/min)、料液比(C/g:mL)和乙醇濃度(D/%)為因素，金線蓮中總黃酮提取率為響應值(Y)，設計四因素三水平的響應面試驗。實驗設計水平表見表1。

表1 實驗設計水平表

2.5 驗證實驗

稱取金線蓮藥材3份，按照最佳工藝條件進行提取，按照“2.1項金線蓮總黃酮的提取工藝”，按“2.2總黃酮含量測定”項測定金線蓮總黃酮提取率。

3 結果與討論

3.1 單因素實驗結果

3.1.1 溫度對總黃酮提取量的影響

超聲波提取溫度對金線蓮總黃酮提取效果的影響見圖2。由圖2可知，溫度對金線蓮總黃酮的提取量具有一定的影響，在20～60 ℃隨著溫度的增加逐漸增加，當溫度為60 ℃時總黃酮提取量最高；當提取溫度升至70 ℃時，總黃酮提取量呈下降趨勢，這可能是由于溫度超過60 ℃會引起乙醇溶劑的蒸發，降低了乙醇溶劑的濃度，導致總黃酮溶出量下降。因此，提取溫度最好控制在60 ℃。

圖2 溫度變化對總黃酮提取的影響

3.1.2 超聲時間對總黃酮提取量的影響

超聲時間對金線蓮總黃酮提取效果的影響見圖3。圖3顯示，超聲時間較短時，總黃酮提取量較小，可能時間較短不利于金線蓮總黃酮的提取。隨著超聲時間的增加其提取量逐漸增加，超聲波的空化作用加速了金線蓮細胞內總黃酮的溶出，當超聲時間為80 min時總黃酮提取量最高，之后就有下降的趨勢，可能是超聲時間過長導致金線蓮中其他成分的溶出，從而降低了總黃酮溶出的比例。又因為總黃酮提取量變化不大，選擇40，50，60 min來進行響應面優化考察。

圖3 超聲時間變化對總黃酮提取的影響

3.1.3 料液比對總黃酮提取量的影響

超聲提取料液比對金線蓮總黃酮提取效果的影響見圖4。由圖4可知，總黃酮的提取量隨著料液比的增加而逐漸上升到趨于平穩。料液比為1∶35，1∶40，1∶45時，從圖4看到總黃酮提取量有微弱增加但相差不大，基本已趨于平穩。在保證總黃酮提取量的基礎上，考慮到節約溶劑的用量及成本問題，選擇1∶40為考察最佳料液比。

圖4 料液比變化對總黃酮提取的影響

3.1.4 乙醇濃度對總黃酮提取量的影響

超聲提取乙醇濃度對金線蓮總黃酮提取效果的影響見圖5。由圖5可知，金線蓮總黃酮提取量隨著乙醇體積分數的增加而升高，當乙醇濃度為80%時，對總黃酮的提取效果最好，乙醇濃度提升至95%時，總黃酮提取量反而減少。其原因可能為總黃酮包括黃酮及其苷類化合物，在乙醇濃度較低時，表現出水的極性，具有羥基的苷類化合物先溶出；隨著乙醇濃度逐漸提高，極性降低，疏水性的逐漸溶出；乙醇體積分數過高，會增加相關雜質溶出降低了總黃酮提取率。因此，選擇乙醇的體積分數為80%最佳。

圖5 乙醇濃度變化對總黃酮提取的影響

3.2 響應面實驗結果

響應面法實驗設計方案與結果見表2。

表2 響應面分析方案及試驗結果

對表2中金線蓮總黃酮提取量(Y)及四個影響因素進行二次回歸模型擬合，其結果見表3可知。

表3 響應面分析法方差分析

對表3實驗數據進行多元回歸擬合，得到的二元多項回歸方程為：

R=5.84-0.078A+0.15B+0.15C+0.59D+0.056AB+0.25AC-0.089AD-0.49BC-0.23BD-0.44CD-0.37A2-0.25B2-0.33C2-0.41D2

由表3分析結果看，整體模型的P<0.01，表明該二次方程模型極顯著。而且方程的失擬項不顯著(P>0.05)，說明非試驗因素對試驗結果的影響不大，可用于金線蓮總黃酮提取實驗預測。因素D，BC，CD，A2，D2為顯著影響因素。兩兩因素之間的交互作用中，超聲時間和料液比的交互作用、料液比和乙醇濃度的交互作用對金線蓮黃酮提取效果影響顯著。

由結果可知，模型的相關系數R2=0.9325，說明因變量和自變量之間線性關系顯著且擬合度較好實驗誤差影響較小。說明應用響應面法優化的金線蓮總黃酮提取工藝準確可靠。

金線蓮總黃酮提取的等高線圖與響應面3D圖見圖6。直觀地看交互作用的響應面曲線圖就能發現各因素對響應值的影響。在響應面曲線圖中交互作用影響總黃酮提取率的顯著性與響應面的坡度相關，曲面圖中若曲面坡度陡峭則因素發生較小變化時總黃酮提取率數值就會改變較大，那么兩個因素結合在一起對實驗結果影響較大。圖6(i)中，控制AD兩因素不變，B超聲時間與C料液比交互作用導致曲面坡度陡峭即總黃酮提取率變化較大。

圖6 金線蓮總黃酮提取響應面分析等高線(a,c,e,h,j,l)及響應面(b,d,f,i,k,m)

3.3 最佳提取工藝

根據Expert 8.0.6 軟件分析結果，金線蓮黃酮的最佳提取工藝為：提取溫度45.01 ℃，超聲時間57.77 min，料液比為1∶30，乙醇濃度為80%，此條件下金線蓮黃酮提取率預測值為6.25 mg/g。

3.4 驗證實驗

為確保該工藝的穩定性與合理性，根據響應面法得出的最佳提取工藝條件進行三組驗證實驗，按照2.1項方法制備供試品溶液，測定金線蓮總黃酮含量。為方便實驗具體操作，將提取溫度設定為45 ℃，超聲超聲時間58 min，料液比為1∶30，乙醇濃度為80%。實際測得金線蓮黃酮平均提取量為6.20 mg/g，與理論預測值6.25 mg/g相比無顯著性差異(P<0.01)。因此，采用Box-Benhnken的中心組合試驗設計優化的金線蓮黃酮提取工藝條件穩定可行，準確可靠。

表4 驗證實驗結果

4 結 論

本研究采用響應面法(Design-Expert軟件)[26]考察金線蓮中黃酮的提取工藝，并且根據二次方程模型分別做出了試驗因素間交互作用的三維立體響應曲面和等高線圖。結果顯示，二次方程的模擬回歸差異顯著，表明實驗建立模擬回歸方程能較好地反映影響因素與響應值之間的關系，實驗設計可靠。

本實驗首先通過單因素試驗分析不同因素對金線蓮總黃酮提取量的影響，確定了合適的提取條件；再根據 Box-Benhnken 的中心組合試驗設計原理，以金線蓮總黃酮提取量為響應值，溫度(A/℃)、超聲時間(B/min)、料液比(C/g∶mL)和乙醇濃度(D/%)為影響因素設計的響應面分析實驗。通過對響應值結果分析，獲得金線蓮總黃酮最佳提取工藝為：提取溫度 45 ℃，超聲超聲時間58 min，料液比為1∶30，乙醇濃度為80%。通過驗證實驗，與模型預測值基本相符，證明了該工藝的可行性。該提取工藝可為金線蓮總黃酮的進一步開發利用研究提供科學依據，具有良好的應用前景。