苯丙酮酸生物轉化產物的抑菌活性研究*

冀慧穎，李雪兒，李明華

(江蘇食品藥品職業技術學院，江蘇 淮安 223003)

隨著人們健康意識的增強和對食品安全性要求的日益提高，要求以天然防腐劑取代化學防腐劑的呼聲越來越強烈。微生物代謝產物作為天然防腐劑的重要來源之一，因其安全性高、抑菌譜廣、生產成本低等優點而日益受到科研工作者的青睞。在眾多微生物中，乳酸菌作為國際公認安全級(GRAS)微生物，其多種代謝產物在防腐行業中具有重要的應用潛力，如細菌素[1]、乳酸[2]和苯基乳酸(PLA)[3]等物質。

PLA具有安全性高、穩定性強、抗菌活性強、抗菌譜廣等優點，在食品、飼料和藥品行業中具有重大的應用潛力[4]。在能夠合成PLA的多種乳酸菌中，乳桿菌(Lactobacillus)因易培養、合成效率高，已受到越來越多科技工作者的關注。近年來，通過對Lactobacillus發酵條件優化[5]、菌種誘變[6]、細胞透性化[7]等手段，使PLA的產量得到較大程度的提高。在本研究中，將對植物乳桿菌(L.plantarum)靜息細胞催化苯丙酮酸(PPA)得到的PLA進行分析，并對其抑制細菌和霉菌的活性進行初步研究。

1 實 驗

1.1 菌株與試劑

植物乳桿菌(L.plantarum)，本實驗室分離保存[8]；大腸桿菌(Escherichiacoli)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，擴展青霉(Penicilliumexpansum)和黃曲霉(Aspergillusflavus)菌株購于上海保藏生物技術中心。MRS培養基、LB培養基、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基(PDB)及其相應固體培養基均購于杭州微生物試劑有限公司。PPA、D-PLA和L-PLA購于阿拉丁試劑公司，其它試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HP1100高效液相色譜儀(HPLC)，美國安捷倫；ZD85A恒溫振蕩器，江蘇金壇；DNP-9052恒溫培養箱，上海精宏；R1005旋轉蒸發儀，上海越眾；722G分光光度計，上海精科；AL104電子天平，上海梅特勒-托利多；MNT-150數顯游標卡尺，德國美耐特。

1.3 實驗方法

1.3.1 苯基乳酸生物催化制備

應用植物乳桿菌靜息細胞轉化PPA制備PLA[9]，轉化完成后，將轉化液于4 ℃、10000 rpm離心機內離心10 min后，上清液用旋轉蒸發儀60 ℃下真空濃縮至原體積的十分之一，然后在濃縮液中按1∶1(v/v)比例加入乙酸乙酯萃取，將萃取液合并后加入適量Na2SO4除水，最后應用旋轉蒸發儀除去乙酸乙酯即得PLA粗提物。將獲得的產物用大賽璐手性柱OB-H進行檢測，流動相為己烷/異丙醇/三氟乙酸(98/2/0.05)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫為25 ℃。

1.3.2 苯基乳酸最低抑菌濃度測定

采用倍半稀釋法測定PLA對細菌和霉菌的最低抑制濃度(MIC)[10]。將LB培養基分裝至多支試管，每支試管加培養基10 mL，然后加無菌PLA粗提物至終濃度分別為0.5～10 mg/mL，再加入50 μL細菌新鮮培養液，37 ℃、150 rpm搖床內培養18 h；將霉菌孢子加到含同等濃度PLA的PDB培養基中，使孢子濃度約1×105CFU/mL，28 ℃、150 rpm搖床內培養24 h。根據細菌和霉菌的生長情況及吸光值確定PLA的最低抑菌濃度。

1.3.3 苯基乳酸對細菌生長曲線影響的測定

根據PLA對細菌的抑菌能力，分別測定其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長曲線的影響。將過濾除菌的PLA加入瓶裝量為150 mL的500 mL三角瓶內，至終濃度分別為0.5 MIC和1 MIC，然后在三角瓶內接入培養至16 h的新鮮細菌種子培養液，搖勻后于搖床內37 ℃、180 rmp條件下培養至24 h，定時取樣于600 nm波長下測定吸光值，繪制生長曲線。

1.3.4 苯基乳酸對霉菌孢子萌發的影響

將擴展青霉和黃曲霉分別接種于PDA培養基試管斜面上，28 ℃培養至產生大量分生孢子后，加入無菌水將分生孢子輕輕洗下，振蕩均勻后用無菌水稀釋至濃度為1×105CFU/mL備用。分別取0.5 mL孢子液和濃度為1 MIC和2 MIC的PLA0.5 mL混合均勻，取100 μL混合液滴于凹面載玻片，將載玻片置于培養皿內28 ℃保濕培養，直至空白對照孢子萌發率高于95%時，檢查各處理孢子萌發情況，以孢子芽管長度大于孢子短半徑時視為萌發[11]。顯微鏡下隨機檢查3個視野，記錄孢子總數和萌發數，計算孢子萌發率。

1.3.5 苯基乳酸對霉菌菌絲生長的影響

應用菌絲生長速率法測定PLA對菌絲生長的影響[12]。制備含有不同濃度PLA的PDA固體平板，以無菌水為對照。用打孔器從培養72 h的霉菌菌落邊緣取直徑為5 mm的菌餅，然后菌絲面朝下接種于對照及含PLA的PDA平板中央，28 ℃培養96 h后，用十字交叉法測量菌落直徑。

2 結果與討論

2.1 苯基乳酸粗提產物的檢測

PLA具有兩種不同的構型，即D型和L型，其中D-PLA抑菌能力稍強。PPA經過植物乳桿菌靜息細胞轉化完成后，經過粗提，粗提物由手性柱進行檢測，結果如圖1所示。由圖1可以看出，PPA轉化產物分別在洗脫19.38 s和23.09 s時出現兩個峰，對照標準品圖譜可知，這兩個峰對應的產物分別為D-PLA和L-PLA。由此可見，PPA經過植物乳桿菌轉化后，產物主要為D-PLA和L-PLA，且D-PLA含量較高。

圖1 苯丙酮酸植物乳桿菌轉化產物的HPLC分析

2.2 苯基乳酸對細菌、霉菌的最低抑制濃度

PLA對兩種細菌和霉菌的MIC如表1所示。由表1可以看出，PLA對細菌和霉菌生長均有明顯的抑制能力，其中對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為4 mg/mL，而對擴展青霉和黃曲霉的MIC分別為6 mg/mL和8 mg/mL。由表1還可以看出，PLA對供試霉菌的MIC比供試細菌高，這說明PLA對細菌生長的抑制能力要明顯優于霉菌。

表1 PLA對細菌和霉菌的最低抑制濃度

2.3 苯基乳酸對細菌生長的影響

為了進一步確定PLA對細菌生長的抑制程度，分別測定了不同PLA濃度下大腸桿菌和金黃色葡萄球的生長情況，供試PLA濃度分別為0.5 MIC和1 MIC，即2 mg/mL和4 mg/mL，以無菌水做對照，結果如圖2所示。由圖2可知，培養基內不加PLA時，兩種細菌的生長速度都較快，在培養4 h后即進入對數生長期，再培養10 h后達到穩定期，OD600分別為2.22和2.41。而培養基內存在0.5 MIC PLA時，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長均受到顯著的抑制，其中對數生長期由4 h推遲到10 h，培養至24 h時，菌體濃度遠遠低于對照，OD600僅為1.23和1.32。當PLA濃度提高到1.0 MIC時，兩種細菌幾乎不生長。由此可以看出，PLA對細菌生長的抑制能力是比較強的。

圖2 PLA對大腸桿菌(a)和金黃色葡萄球菌(b)生長的影響

2.4 苯基乳酸對霉菌孢子萌發及菌絲生長的影響

霉菌的繁殖可通過孢子和菌絲斷裂兩種方式進行，因此，實驗通過測定PLA抑制孢子萌發和菌絲生長兩種方式確定該物質的抗霉活性。

圖3(a)表明，PLA對擴展青霉和黃曲霉分生孢子萌發均具有顯著的抑制活性。在對照處理孢子萌發率大于95%時，0.5 MIC PLA處理的擴展青霉和黃曲霉分生孢子萌發率僅為43.34%和51.25%，對孢子萌發的抑制率分別達54.38%和46.05%。當將PLA濃度提高到1.0 MIC時，僅有少量孢子萌發，抑制率高達95%以上。

圖3 PLA對霉菌孢子萌發(a)和菌絲生長(b)的影響

PLA對擴展青霉和黃曲霉菌絲生長也有顯著的抑制活性，如圖3(b)所示。在對照平板中，供試霉菌菌絲能夠快速生長，培養至96 h時，菌落直徑即達23～25 mm，而在含有0.5 MIC PLA的平板上，菌絲生長受到明顯抑制，擴展青霉和黃曲霉菌落直徑分別為16.7 mm和14.2 mm，菌絲生長抑制率分別為42.08%和49.17%，當PLA濃度提高到1.0 MIC時，對兩種霉菌菌絲生長抑制率分別提高到了79.21%和85.08%。由此可以看出，PLA對霉菌菌絲生長也具有明顯的抑制活性，且黃曲霉較擴展青霉對PLA更加敏感。

3 結 論

應用植物乳桿菌靜息細胞，可將PPA轉化為PLA，且D-PLA較L-PLA含量高。PLA能夠顯著抑制細菌的生長、霉菌孢子萌發，還具有較高的抑制菌絲生長的活性，展現出了較強的抗菌能力。