肽類合成方法研究進展

于鐵妹

(深圳瑞德林生物技術(shù)有限公司，廣東 深圳 518000)

酰胺鍵在自然界分子中是非常常見的化學(xué)鍵，蛋白質(zhì)作為酰胺鍵的代表性物質(zhì)，在生物體內(nèi)發(fā)揮著非常重要的作用，比如酶催化、信號傳遞和結(jié)構(gòu)組成。此外，肽類具有許多重要的生物活性，如抗菌活性和信息素活性，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和工業(yè)上都有廣泛的應(yīng)用。

肽的分類較為復(fù)雜，目前尚無較為一致的分類方法，根據(jù)肽鏈長度可分為二肽、三肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)。一般說來，肽鏈上氨基酸數(shù)目在10個以內(nèi)的叫寡肽，10～50個的叫多肽，50個以上的叫蛋白質(zhì)。人們習(xí)慣上也把寡肽中的二、三肽稱為小肽。由于構(gòu)成肽的氨基酸種類、數(shù)目與排列順序的不同，決定了肽紛繁復(fù)雜的結(jié)構(gòu)與功能。

傳統(tǒng)的肽類合成方法是化學(xué)法?；瘜W(xué)合成反應(yīng)高度取決于肽鏈序列，隨著肽鏈的復(fù)雜性增加，方法開發(fā)和分析變得至關(guān)重要。盡管化學(xué)法合成多肽取得了長足的進展，但是在長肽鏈、蛋白質(zhì)合成上仍然是化學(xué)領(lǐng)域的巨大挑戰(zhàn)。隨著基因工程、酶定向進化技術(shù)的發(fā)展，逐漸開發(fā)出化學(xué)酶法及酶法。本文將分別介紹這幾種肽類合成方法并進行比較。

1 化學(xué)法

目前，化學(xué)法合成肽類仍然是生產(chǎn)治療性肽的首選方法，因為它可以合成幾乎任何想要的肽序列，包括非蛋白氨基酸肽。一般來說，化學(xué)多肽合成包括保護、激活、縮合和去保護幾個主要步驟。目前市場上肽類產(chǎn)品是由從2～50個氨基酸組成。隨著肽鏈復(fù)雜性的增加，化學(xué)合成方法的開發(fā)和分析變得至關(guān)重要?；瘜W(xué)合成路線中主要問題包括片段的低溶解性和消旋問題。隨著肽鏈長度的增加，雜質(zhì)的種類和含量增加，雜質(zhì)與最終產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)很相似，將大幅增加純化難度導(dǎo)致最終產(chǎn)品成本的增加。傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法包括液相合成(SPS)和固相合成(SPPS)，新型化學(xué)合成方法有自然化學(xué)連接法(Native chemical ligation，NCL)。

1.1 液相合成

液相合成(SPS)是第一個發(fā)展起來的肽合成方法，它既包括逐步偶聯(lián)反應(yīng)，也包括肽段偶聯(lián)反應(yīng)。液相合成有多種偶聯(lián)的方法，最常用的肽段偶聯(lián)方法是羰化二亞胺法[1]。耦合劑DCC用于活化N端保護的氨基酸羧酸基團，在親核試劑的進攻下形成酰胺鍵。加入偶聯(lián)劑，如1-羥基苯并三唑(HOBt)，可防止外消旋，提高效率。液相多肽合成是一種可規(guī)?；a(chǎn)的方法，主要應(yīng)用于小肽(<10個氨基酸)的合成。缺點是氨基酸需要保護，每一步反應(yīng)后都需要分離和純化中間體。因此，液相合成大于 10個氨基酸的長肽，合成步驟繁瑣、耗時、高成本。另外一個問題是C端氨基酸在溶液中易消旋，因此首選的偶聯(lián)位置是Gly-Xxx或Pro-Xxx。此外，隨著肽尺寸的增加，片段的溶解度將成為偶聯(lián)的主要問題[2]。

1.2 固相合成

固相肽合成(SPPS)是由Merrifield于1963年發(fā)明。SPPS可實現(xiàn)自動化肽合成，徹底改變了整個化學(xué)肽合成領(lǐng)域。目前，SPPS是合成中小型多肽(<50個氨基酸)的首選方法，多種藥物肽的合成均采用SPPS方法。SPPS是將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價鍵的形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸脫去保護基后作為氨基供體與過量的另一活化羧基組成形成酰胺鍵，實現(xiàn)延伸肽鏈。SPPS的主要步驟包括縮合洗滌去保護中和及洗滌下一輪縮合操作，直到實現(xiàn)所要合成的肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得多肽成品，如圖1所示。其中α-氨基用Boc(叔丁氧羰基)保護的稱為Boc固相合成法。α-氨基用Fmoc(9-芴甲氧羰基)保護的稱為Fmoc固相合成法。Fmoc固相合成法是目前工業(yè)應(yīng)用普遍采用的方法。

圖1 固相合成(SPPS)多肽原理示意圖

SPPS的缺點是每一次循環(huán)反應(yīng)均需要大量的試劑，產(chǎn)生大量的廢液(每生成1 kg多肽藥物需要1000 L溶劑)[1]。后期需要昂貴的制備色譜去除具有類似結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)，進一步增加了生產(chǎn)成本。SPPS的上述缺點也限制了其在多肽合成中的生產(chǎn)規(guī)模。此外，超過10個氨基酸的肽往往形成三級結(jié)構(gòu)，使進一步的合成困難。因此，SPPS的工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模受到一定的限制。

1.3 NCL法(Native chemical ligation)

NCL是一個相對較新的化學(xué)合成方法，能夠在緩沖液中將未保護的肽片段縮合形成新的肽鏈。NCL法是將硫酯形式的?；w肽段與親核氨基供體通過兩步反應(yīng)進行縮合。第一步是可逆的硫與硫酯的交換反應(yīng)，第二步是將S->N ?；D(zhuǎn)移至新縮合的肽鏈上形成酰胺鍵，該反應(yīng)自發(fā)進行且不可逆，如圖2所示。NCL法已被成功用于200個氨基酸以上的蛋白質(zhì)合成[3]。在縮合位置需要半胱氨酸參與反應(yīng)是限制NCL法應(yīng)用的主要原因。另外，需要昂貴的硫酯形式的?；w也限制了NCL法的工業(yè)化應(yīng)用。

圖2 NCL法合成多肽原理圖

2 化學(xué)酶法合成多肽

將化學(xué)法與酶法結(jié)合用于肽類的合成方法稱為化學(xué)酶法，用于化學(xué)酶法合成肽類的酶主要是蛋白酶。利用蛋白酶與化學(xué)法結(jié)合合成肽類具有明顯的優(yōu)勢，反應(yīng)過程氨基酸無需側(cè)鏈保護，反應(yīng)條件溫和可防止外消旋化，并且可以引入所需的區(qū)域選擇性、立體選擇性和底物選擇性。

蛋白酶在生物體類主要催化蛋白質(zhì)的水解反應(yīng)。隨著非水相技術(shù)的發(fā)展，蛋白酶被證明在非水相反應(yīng)體系中仍可催化反應(yīng)并表現(xiàn)出很多特有的性能。本文將主要介紹用于多肽合成的蛋白酶sortase，butelase，subtiligase，peptiligase和omniligase。

sortase A來源于Staphylococcus aureus，廣泛應(yīng)用于肽和蛋白質(zhì)的后修飾。Sortase A專一性識別C端為LPXTG(X為任意氨基酸)的序列，可將LPXTG中Thr與Gly之間的酰胺鍵斷裂再與另一個帶甘氨酸的肽鏈N端相連，實現(xiàn)肽、蛋白質(zhì)的修飾和肽的合成。Sortase A 具有催化活力低，酶用量大，底物特異性強，同時水解副反應(yīng)的存在導(dǎo)致底物轉(zhuǎn)化率不超過50%等缺點。Butelase的發(fā)現(xiàn)克服了部分Sortase A的缺點，Butelase專一性識別C端Asx-His-Val的序列，可將AsX與His之間的酰胺鍵斷裂再與另一任意氨基酸(Xaa)肽鏈的N端相連，實現(xiàn)肽的連接。Butelase的催化效率極高，僅需少量的酶在短時間內(nèi)完成反應(yīng)。Butelase1催化GFP與人生長激素(somatropin)環(huán)化反應(yīng)在15 min完成，轉(zhuǎn)化率95%[4]。盡管如此，Sortase A與butelase在肽鏈合成中仍具有明顯的局限性：(1)明顯的水解副反應(yīng)，導(dǎo)致合成轉(zhuǎn)化率較低，需到大量底物。(2)酶的底物專一性強，僅能識別催化特定的序列。(3)酶本身的不穩(wěn)定性。因此針對蛋白酶法合成肽類的缺點，科學(xué)家們一直在探索改良方法，通過對蛋白酶的定向進化，不斷提高蛋白酶的性能。Peptiligase是一種枯草芽孢桿菌蛋白酶的突變體。Peptiligase無需Ca2+離子，催化C端為carboxamidomethyl(Cam)-ester 的片段與氨基供體縮合成新肽鏈，底物轉(zhuǎn)化率可達90%。同時，Peptiligase 熱穩(wěn)定性好(Tm=66 ℃)，可耐受一定濃度的有機溶劑(如50% DMF)和復(fù)性劑(2M 尿素或鹽酸胍)。Peptiligase 對氨基供體片段具有很強的特異性，偏向于催化N端為Gly、Ala和Ser的氨基供體片段。Toplak 團隊在peptiligase的基礎(chǔ)上，經(jīng)過多輪定點突變，獲得新突變體命名為Omniligase。Omniligase明顯擴大了可催化的氨基供體范圍。Omniligase不僅可用于化學(xué)酶法合成肽類，還可用于線性肽鏈的環(huán)化[5]。Nuijens[6]通過化學(xué)-蛋白酶法成功合成了克級規(guī)模的艾塞那肽。然而，在工業(yè)應(yīng)用方面化學(xué)酶法還處于起步階段。由于催化劑的性能在很大程度上決定了工業(yè)應(yīng)用的可行性，因此酶的發(fā)現(xiàn)和改造仍是該領(lǐng)域的研究重點。

3 酶法合成肽類

ATP依賴型羧酸鹽-胺連接酶可利用活化的羧酸形成乙酰磷酸中間體，催化羧酸(R3C-COOH)和(R3C-NH2)氨基供體縮合形成酰胺鍵。最早發(fā)現(xiàn)的形成酰胺鍵的ATP依賴型酶為生物素脫羧酶(EC6.3.4.14)，D-Ala-D-Ala連接酶(EC6.3.2.4)，谷胱甘肽合成酶(EC6.3.2.3)。其中D-Ala-D-Ala連接酶可利用D型氨基酸合成同型二肽(homodipeptide)，谷胱甘肽合成酶已大規(guī)模應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)谷胱甘肽。除以上酶之外能合成二肽和寡肽的還有L-氨基酸連接酶(LAL)。

LAL屬于ATP依賴型連接酶超家族，該酶可以利用未保護的氨基酸合成二肽及寡肽。第一個報道的Lal來源于Bacillus subtilis 168，由ywfE基因編碼，負責(zé)催化L-丙氨酸和抗莢膜菌素形成抗生素芽孢桿菌溶素(bacilysin)。研究表明，YwfE 催化氨基酸底物合成二肽，二肽的N端偏好結(jié)構(gòu)小的氨基酸如丙氨酸、絲氨酸和甘氨酸。C端偏好大、中性的氨基酸如苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸。很多不同來源的LAL相繼被報道，如RizA，Rsp1486a，BL00235，PSPPH 4299，plu1440，TabS，F(xiàn)tyB。LAL具有不同的底物特異性，如Tabs合成N端為較大的氨基酸，可以生成多種有用的二肽[7]如Arg-Phe(降壓作用)，Leu-Ile(抗抑郁作用)和Leu-Ser(鹽味增強劑)。LAL也可以用于發(fā)酵合成二肽，如以YwfE構(gòu)建的工程菌合成L-Ala-L-Gln(丙谷二肽)[8]。最近LAL被發(fā)現(xiàn)也可生成三肽及以上的寡肽，RizB可催化底物Val和Arg-Ser合成三肽Val-Arg-Ser[9]，Spr0969、BAD1200可合成更長的肽鏈。目前為止，還沒有寡肽合成能力的LAL的晶體結(jié)構(gòu)分析，對該類酶的結(jié)構(gòu)分析更有利用于分析寡肽合成的機理。

4 肽類合成總結(jié)

本文將目前主要的肽類合成方法進行了介紹，包括化學(xué)法、化學(xué)酶法和酶法?，F(xiàn)階段并無一種方法可滿足所有肽類的合成，合成方法的選擇可根據(jù)肽的序列、長度和性質(zhì)等方面進行分析。表1對以上各種方法在規(guī)模、肽鏈長度等多個角度進行了比較分析。在多肽合成中，化學(xué)法仍然是生產(chǎn)藥物肽的首選方法，因為它可以合成幾乎任何想要的肽序列，包括非蛋白質(zhì)氨基酸肽。化學(xué)酶法技術(shù)還處于研究初期，隨著化學(xué)酶法技術(shù)的發(fā)展，特別是基因工程、蛋白質(zhì)工程技術(shù)在新型肽類連接酶的發(fā)掘和改造中的應(yīng)用，將會開發(fā)出越來越多的具有特定性能的肽類連接酶，化學(xué)酶法在肽類合成中的應(yīng)用將展現(xiàn)出越來越明顯的優(yōu)勢。

表1 肽類合成方法比較