正交試驗(yàn)法優(yōu)選四君子湯的提取工藝

張曉曉，馮亞莉，翟廣玉，謝新年

（鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，新鄭 451100）

四君子湯出自《太平惠民和劑局方》，被歷代醫(yī)家推崇為補(bǔ)氣第一方，方中人參性甘溫大補(bǔ)脾胃之氣，為君藥；白術(shù)苦溫，助君藥燥濕健脾，為臣藥；茯苓甘淡，健脾滲濕，為佐藥；炙甘草甘平，益氣和中，調(diào)和諸藥，為使藥。四味藥配伍，益氣健脾，藥性平和，溫而不燥，補(bǔ)而不峻，常服無不良反應(yīng)。現(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，四君子湯不僅具有補(bǔ)益作用[1]，還具有提高免疫力[2]，調(diào)節(jié)胃腸功能[3]，促進(jìn)消化吸收，調(diào)節(jié)脫氧核糖核酸合成，抗疲勞，修復(fù)肝臟，治療兒科疾病（腹瀉、貧血、急性黃疸型肝炎），治療糖尿病、脂肪肝等藥理作用[4]，臨床上具有重要應(yīng)用。

原方中君藥人參常由黨參代替，若以黨參為君藥，則四君子湯的功效側(cè)重于補(bǔ)中益氣，生津養(yǎng)血[5]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾虛證為衰老的主要原因，若脾氣虛弱，機(jī)體具有抗氧化能力的防御系統(tǒng)功能下降，從而引起自由基清除能力降低，最終導(dǎo)致機(jī)體衰老甚至其他嚴(yán)重的疾病[6]。實(shí)驗(yàn)證明，黨參方“四君子湯”清除自由基能力優(yōu)于人參方[7]。

黨參中以皂苷類成分為主，主要藥用成分為黨參炔苷。本文采用正交試驗(yàn)法，以黨參炔苷的含量為指標(biāo)，對(duì)四君子湯的水提工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超聲波清洗機(jī)（濟(jì)南巴克超聲波科技有限公司）；HPLC-1206 安捷倫高效液相色譜儀；分析天平（上海衡平儀器儀表廠）；色譜柱ZORBAXSB-C18（4.6×250mm，5μm）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司金壇區(qū)晶波實(shí)驗(yàn)儀器廠）；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D循環(huán)水式多用真空泵（天津華鑫儀器廠）；調(diào)溫電熱套（上海樹立儀器儀表有限公司）。

黨參，白術(shù)，茯苓，甘草（購于新鄭市學(xué)院路店張仲景大藥房，經(jīng)謝新年教授鑒定為合格藥材）；乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；黨參炔苷對(duì)照品（PCS：181110，純度＞98%）。其他試劑和溶劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水提醇沉

取黨參12g，白術(shù)9g，茯苓9g，甘草6g，加適量蒸餾水浸泡1h。煎煮三次，每次蒸餾水用量均為500mL，合并三次濾液。抽濾，濃縮藥液，在濃縮后的藥液中加入無水乙醇使乙醇濃度達(dá)到75%，慢加快攪，冷藏，靜置沉淀24h，抽濾除雜，得藥液；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將乙醇蒸走，并回收乙醇，最后將藥液濃縮至100mL。

1.2.2 正交實(shí)驗(yàn)

選取浸泡時(shí)間、用水計(jì)量、煎煮時(shí)間及煎煮次數(shù)作為考察因素，各因素取3個(gè)水平（表1），采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選最佳工藝條件[8]。樣品制備：取黨參、白術(shù)、茯苓、甘草按照表1正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案水煎提取，提取液用真空抽濾放冷備用。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選四君子湯煎煮工藝

2 含量測(cè)定

2.1 薄層色譜的鑒別

采用薄層色譜法，比較四君子湯及其單味藥中石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位的化學(xué)成分。

2.1.1 供試品溶液的制備

全方水煎液：按照四君子湯中各藥的配伍比例取黨參9g、白術(shù)9g、甘草9g、茯苓6g，加10倍量的水，浸泡0.5h后，煎煮兩次，每次1h，合并濾液，減壓濃縮至30mL，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，合并每種萃取液，水浴揮干，殘?jiān)蛹状挤謩e定容至10mL。

藥材單煎液：各取黨參9g、甘草9g，分別加入10倍量的水，浸泡0.5h后，煎煮2次，每次1h，合并濾液，減壓濃縮至一定體積，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，合并每種萃取液，水浴揮干，殘?jiān)蛹状挤謩e定容至10mL。

2.1.2 展開劑的選擇

正丁醇部位，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置的下層溶液為展開劑，取出晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別至日光及紫外燈365nm下檢視。乙酸乙酯部位，乙酸乙酯-石油醚（7∶3）展開，取出晾干，在以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置的下層溶液為展開劑，取出晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別至日光及紫外燈365nm下檢視。

測(cè)定結(jié)果：正丁醇部位全方和甘草的點(diǎn)均清晰，黨參中部分成分清晰。乙酸乙酯部位全方、甘草、黨參均清晰，如圖1所示。

圖1 薄層色譜測(cè)定結(jié)果

2.2 黨參炔苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；色譜柱：ZORBAXSBC18（4.6×250mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈∶水=25∶75；波長218nm；柱溫為常溫25℃；流量為1.0mL/min；進(jìn)樣量：

10mL[9]

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取黨參炔苷對(duì)照品0.48mg至1mL的容量瓶中，以甲醇定容，搖勻。取對(duì)照品溶液依次稀釋為：0.019 2、0.048 0、0.096 0、0.192 0、0.240 0mg/mL的黨參炔苷對(duì)照品溶液。分別準(zhǔn)確吸取上述對(duì)照品溶液10μL，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。黨參炔苷回歸方程為y=14 368x-112.14（R2=0.963 2），其中y為峰面積，x為質(zhì)量濃度，R為相關(guān)因數(shù)。表明當(dāng)黨參炔苷進(jìn)樣濃度在0.019 2～0.048 00mg/mL時(shí)線性關(guān)系良好。見圖2。

圖2 黨參炔苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 水提工藝優(yōu)選結(jié)果

以黨參炔苷提取量為參考指標(biāo)，選擇浸泡時(shí)間、用水計(jì)量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)為考察因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，因素水平見表1。按處方比例稱取黨參，白術(shù)，茯苓，甘草各9份，按L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。

直觀分析顯示，各因素對(duì)水提工藝的影響順序?yàn)镈＞A＞B＞C。結(jié)果表明D，A對(duì)提取工藝的影響具有顯著性差異，結(jié)合實(shí)際考慮，確定最佳提取工藝為A3B3C2D3，即浸泡時(shí)間為120min，用水計(jì)量為12倍，煎煮時(shí)間為1h，煎煮次數(shù)為3次。準(zhǔn)確稱取處方量藥材3份，按優(yōu)選工藝進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果證明黨參炔苷提取量分別為0.235 5，0.240 2，0.236 9，表明該工藝穩(wěn)定可行。

表2 黨參炔苷正交實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果表

3 結(jié)論

采用正交試驗(yàn)法，以黨參炔苷的含量為指標(biāo)，對(duì)四君子湯的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。采用高效液相法進(jìn)行測(cè)定，浸泡時(shí)間為120min，用水劑量為12倍，煎煮時(shí)間為1h，煎煮次數(shù)為3次時(shí)黨參炔苷的含量最高，為最佳提取工藝。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為四君子湯的工業(yè)生產(chǎn)及劑型改進(jìn)提供了一定的依據(jù)。