超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定水產品中6種丁香酚類物質的殘留量

吳少明，蔡小明，周 鵬，蔡慧欽，梁 敏，陳言凱，李燕平，馮麗鳳，林浩學，黃 媛

（福建省產品質量檢驗研究院，國家加工食品質量監督檢驗中心，福建 福州 350002）

丁香酚類化合物，主要包括丁香酚與異丁香酚、甲基丁香酚與甲基異丁香酚、乙酸丁香酚酯與乙酰基異丁香酚3 組同分異構體，自20世紀70年代初被發現具有強烈的麻醉作用而被廣泛用于動物運輸過程[1]。近年來，人們發現鮮活水產品在運輸、批發等環節添加丁香酚類物質能夠有效地改變其生理狀態，進入類休眠狀態，大大降低生理代謝強度，有效提高在運輸途中的成活率，從而增加經濟效益[2-3]。然而，研究表明丁香酚類物質具有肝臟毒性[4-5]；美國國家毒理學計劃認為丁香酚是可疑致癌物[6]；世界癌癥研究機構也將丁香酚列為第3類致癌物[7]；李付貴等[8]證明了丁香酚是一種強胚胎毒性化合物；孔曉軍等[9]對丁香酚進行毒理學實驗表明丁香酚會導致人體代謝性酸中毒，還可以導致嬰幼兒患低血糖和肝功能衰竭。不同國家對丁香酚類物質的限量標準并不一致，新西蘭曾規定食品中丁香酚的最高殘留限量為0.1 mg/kg[10]，而后在2016年撤銷[11]，日本規定丁香酚最高殘留限量為0.05 mg/kg[12]，美國和加拿大則禁止丁香酚作為食品添加劑或者麻醉劑使用[13-14]，其他5 種丁香酚類物質的限量值還未有相應的規定。我國對丁香酚類的使用及限量值尚無明確規定。

目前，丁香酚的檢測方法主要有紫外分光光度法、薄層色譜法、毛細管電泳法、氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-串聯質譜法、液相色譜-串聯質譜法等。向英等[15]采用分光光度法測定丁香油中丁香酚的含量，不僅溶劑消耗大且靈敏度較低；Pathak等[16]采用薄層色譜法建立了丁香中丁香酚的含量測定，但該法易受干擾導致定性定量不準確，且溶劑揮發對人體危害也較大；黃先敏等[17]建立了山茱萸中丁香酚的毛細管電泳法測定，該法靈敏度高，但重現性較差，無法準確定量；色譜法[18-21]具有高分離性、高選擇性以及高靈敏度成為水產品中丁香酚類物質測定的主流檢測方法，但前處理仍相對復雜，步驟多，耗時長，效率低，且容易存在干擾，已無法滿足大批量樣品快速檢測的要求。近年來，色譜-質譜聯用技術具有前處理簡單、靈敏度高、穩定性好、定性定量更準確等特點而被廣泛用于痕量分析[22-23]，已有研究者[24-28]將氣相色譜-串聯質譜法成功應用與水產品中6 種丁香酚類物質的測定，以及倪崢飛[29]和趙東豪[30]等采用超高效液相色譜-串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法建立了丁香酚類物質的測定方法，但目前報道的采用液相色譜-串聯質譜法針對的是丁香酚單一化合物或者幾種化合物，同時測定6 種（3 組同分異構體）丁香酚類物質（丁香酚與異丁香酚、甲基丁香酚與甲基異丁香酚、乙酸丁香酚酯與乙酰基異丁香酚）的方法鮮見報道。因此，本研究采用UPLC-MS/MS建立同時測定水產品中6 種丁香酚類物質的方法，并對市場上實際水產樣品中丁香酚類物質殘留進行污染調查，以期為水產品中多種丁香酚類物質殘留檢測提供技術支持，也為水產品中丁香酚類物質的進一步研究提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丁香酚（CAS號97-53-0，純度98.95%）、異丁香酚（CAS號97-54-1，純度98.06%）、甲基丁香酚（CAS號93-15-2，純度98.06%）、乙酸丁香酚酯（CAS號93-28-7，純度99.4%）、甲基異丁香酚（CAS號93-16-3，純度99.1%）、乙酰基異丁香酚（CAS號93-29-8，純度98.2%） 美國Stanford公司；甲酸、乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

L C-3 0 A D U P L C儀、H L B固相萃取柱（3 mL/60 mg）、Shim-pack GIST C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，2 μm） 日本Shimadzu公司；5500三重四極桿-串聯質譜儀（配有電噴霧離子源） 美國AB SCIEX公司；Aanti J-E高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；Milli-Q超純水純化系統 美國Millipore公司；DS-8510 DTH超聲波振蕩器 上海分析超聲儀器有限公司；MS 3 basic旋渦混均器 德國IKA公司；C18固相萃取柱（3 mL/60 mg）、PEP固相萃取柱（3 mL/60 mg） 美國Agela公司；BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、BEH C8色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 質譜條件

電噴霧離子源：正負離子切換模式；多反應監測；離子化電壓：正離子掃描模式為5 500 V，負離子模式為－4 500 V；霧化氣60 psi；輔助氣55 psi；氣簾氣壓力30 psi；霧化溫度550 ℃；定性離子對、定量離子對及其他質譜參數見表1。

表1 質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，2 μm）；柱溫40 ℃；進樣量2.0 μL；流速0.3 mL/min；流動相：水（A）和甲醇（B），梯度洗脫程序：0～1.00 min，90% A、10% B；1.0～2.0 min，90%～45% A、10%～55% B；2.0～2.00 min，45% A、55% B；5.0～9.0 min，45%～5% A、55%～95% B；9.0～11.0 min，5% A、95% B；11.00～11.01 min，5%～90% A、95%～10% B；11.01～13.0 min，90% A、10% B。

1.3.3 標準溶液及標準曲線的配制

分別準確稱取適量6 種丁香酚類物質標準品于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解后定容至刻度，充分混勻得到標準儲備液約1.0 mg/mL，于－18 ℃冰箱中避光保存。分別移取適量標準儲備液以乙腈稀釋成質量濃度均為100 ng/mL的混合標準中間液，再分別移取適量混標中間液以體積分數10%乙腈溶液稀釋成1.00、2.00、5.00、20.0、50.0、100、500 ng/mL的混合標準系列溶液，現配現用。

1.3.4 樣品前處理

先將魚、蝦、蟹等水產品洗凈，取可食肌肉部分樣品于組織勻漿機攪碎混勻，放入－18 ℃冰箱保存，備用。稱取勻漿后的待測樣品2.0 g于50 mL聚丙烯塑料離心管中，加入2 g無水硫酸鈉，渦旋混勻后加入5 mL乙腈，振蕩提取10 min后，于4 500 r/min離心5 min，轉移上清液至10 mL試管中，殘渣再加入5 mL乙腈重復提取一次，合并2 次提取液，過HLB小柱凈化（使用前用3.0 mL乙腈活化），收集流出液于10 mL刻度試管中，再加入2 mL乙腈洗脫，并收集流出液，加入100 μL二甲亞砜后于50 ℃水浴下氮吹至近干，加入10%乙腈溶液溶解定容至1.0 mL，渦旋混勻后過0.22 μm PTFE濾膜，UPLC-MS/MS分析測試。

1.4 數據統計與分析

采用Excel 2007軟件進行平均值、回收率及相對標準偏差計算，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優化

2.1.1 質譜條件的優化

圖1 丁香酚類物質產物離子掃描質譜圖Fig. 1 Product ion scanning mass spectra of eugenols

分別取適量儲備液以50%乙腈稀釋成質量濃度約為200 ng/mL的單標使用液，采用針泵連續進樣模式進樣分析（針泵速率為10 μL/min）。根據目標物的性質，丁香酚與異丁香酚含有酚羥基，較易失去一個質子得到母離子m/z163 [M－H]－，其余4 種化合物采用正離子模式，分別得到一個質子形成母離子[M－H]+，分別繼續進行產物離子掃描，并采用信號疊加模式，分別得到6 種化合物的主要碎片離子（圖1），并優化各化合物相關檢測參數，選擇最優定量定性離子對（表1）。從圖1可以看出，除丁香酚（m/z121.0）和異丁香酚（m/z119.0）的1 個碎片離子不同外，其余2 對同分異構體的母離子和碎片離子均相同，一部分可能的質譜解析見文獻[31]，因此無法單靠質譜提取分離目標物進行定性，需要通過色譜條件將3 對同分異構體完全分離，才能準確進行定性定量分析。

2.1.2 液相色譜條件的優化

2.1.2.1 色譜柱的選擇

圖2 丁香酚類物質的多反應監測模式色譜圖Fig. 2 Multiple response monitor chromatograms of 6 eugenols

文獻[27,32]報道測定多種丁香酚類物質采用C18色譜柱，本研究選擇較常見的BEH C18、BEH C8、HSS T3、Shim-pack GIST C18色譜柱，以甲醇-水作為流動相進行梯度洗脫優化實驗。結果表明Shim-pack GIST C18色譜柱效果最好，在7.5 min之前能將3 對丁香酚同分異構體達到基線分離，且峰形較好（圖2），因此選擇Shim-pack GIST C18色譜柱作為分析柱。

2.1.2.2 流動相的選擇

先對甲醇-水和乙腈-水作為流動相的效果進行比較，結果表明，采用甲醇-水作為流動相時，6 種化合物的峰形及響應均優于乙腈-水作為流動相。此外，流動相的pH值以及離子強度的大小可能對目標物響應有影響，于是對比了在水相中添加不同濃度的甲酸以及乙酸銨對結果的影響。結果顯示，隨著乙酸銨濃度的增大，6 種丁香酚類物質響應均逐漸降低，說明流動相中加入乙酸銨會降低6 種丁香酚類物質的響應；而只要流動相中加入甲酸，丁香酚和異丁香酚則完全被抑制，且其余4 種化合物響應沒有明顯變化，因此最終選擇甲醇-水作為流動相，而文獻[26,31]則認為采用甲醇-乙腈-0.01%甲酸作為流動相效果更佳。

2.2 前處理條件的優化

2.2.1 提取溶劑的選擇

圖3 提取溶劑的選擇Fig. 3 Selection of extraction solvents

丁香酚類物質屬于極性或者弱極性化合物，微溶于水，文獻中報道的提取溶劑有甲醇[32]、乙腈[24]、正己烷[27]、丙酮[18]等。本實驗選取空白明蝦樣品進行加標回收實驗，對比甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、丙酮作為6 種丁香酚類物質提取溶劑的效果，后續實驗按1.3.4節步驟進行，平行實驗3 次。如圖3所示，采用甲醇、乙腈提取時，6 種丁香酚類物質回收率均較好，分別為82.5%～95.1%、84.7%～94.7%，相對標準偏差分別為2.1%～5.2%、2.8%～4.1%；而其余3 種提取溶劑所得的回收率結果不理想；但甲醇作為提取溶劑時，溶液顏色較深；此外，在最后濃縮過程中乙腈的濃縮速度也較甲醇快，因此綜合考慮選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2.2 提取溶劑體積的優化

圖4 提取溶劑體積對丁香酚類物質回收率的影響Fig. 4 Effect of extraction solution volume on recovery of eugenols

為進一步確定提取溶劑的體積，選擇陰性明蝦樣品進行加標回收實驗（加標水平為1.0 mg/kg），以20 mL乙腈分4 次進行提取，每次以5 mL乙腈提取，分別收集每次的提取溶液按1.3.4節方法進行后續實驗，平行實驗3 次。如圖4所示，一次5 mL乙腈提取時，6 種丁香酚類物質回收率僅為52.1%～72.1%；2 次5 mL乙腈提取時，6 種丁香酚類物質回收率在84.1%～94.5%之間，相對標準偏差在2.1%～4.5%之間；而超過2 次時，結果與2 次5 mL乙腈提取時并無明顯變化，綜合考慮后續濃縮效率以及節約溶劑方面，最終選擇采用2 次5 mL乙腈提取。

2.2.3 凈化條件的優化

2.2.3.1 固相萃取柱的選擇

由于水產品基質較為復雜，含有大量脂溶性雜質，若直接進樣會產生基質效應以及對儀器造成一定程度的污染，因此需對提取后的溶液進行凈化處理。根據6 種丁香酚類物質的性質，比較HLB小柱（可吸附極性和非極性雜質）、C18小柱（可吸附脂類等非極性雜質）、PEP小柱（可吸附極性和非極性雜質）的凈化效果，以陰性明蝦進行加標回收實驗（加標水平為20 μg/kg），上樣后再以5 mL乙腈洗脫固相萃取柱，其余步驟按1.3.4節進行，平行實驗3 次。結果表明，采用HLB柱凈化時，6 種丁香酚類物質平均回收率均較好，在88.5%～95.1%之間，相對標準偏差在2.2%～5.1%之間，且基線噪音低；而采用C18柱凈化時，乙酸丁香酚酯平均回收率較低（67.5%）；采用PEP固相萃取柱凈化時，異丁香酚平均回收率較低（50.2%），因此，選擇HLB柱作為凈化小柱。

2.2.3.2 洗脫劑體積的優化

圖5 洗脫劑體積對丁香酚類物質回收率的影響Fig. 5 Effect of elution solvent volume on recovery of eugenols

由于采用乙腈作為提取溶劑，若經固相萃取柱凈化后，溶液體積過大會影響濃縮效率，有必要進一步對洗脫劑體積進行優化。以空白明蝦為基質，進行加標回收實驗（加標水平為500 μg/kg），上樣后以5 mL乙腈分5 次洗脫固相萃取柱，每次1 mL，并分別收集每次的洗脫溶液按1.3.4節進行后續實驗，平行實驗3 次。如圖5所示，當洗脫溶劑達到2 mL時，6 種丁香酚類物質基本洗脫下來，平均回收率在84.5%～97.2%之間；而當洗脫溶劑繼續增加時，6 種丁香酚類物質回收率與2 mL洗脫時并無明顯差異，因此，選擇洗脫體積為2 mL。

2.2.4 濃縮條件的優化

2.2.4.1 濃縮溫度

丁香酚類物質沸點均高于180 ℃，但文獻[27]認為在氮吹濃縮時，水浴溫度高于45 ℃時，丁香酚類物質易揮發或者分解導致回收率降低。因此本實驗考察在乙腈溶劑中加入6 種丁香酚類物質（質量濃度均為20 ng/mL），分別在溫度30、40、50、60 ℃進行濃縮至近干（剩余約0.2 mL），加入10%乙腈溶液定容至1.0 mL，并渦旋混勻，過濾膜后上機測試。結果表明，濃縮溫度為30～60 ℃，6 種丁香酚類物質回收率均在97.5%以上，并不存在回收率降低現象。

2.2.4.2 濃縮至干的影響

在濃縮過程中濃縮至干時，一些化合物有可能會隨溶劑揮發被帶走一部分，或者被氧化成其他化合物。因此，在乙腈溶劑中加入6 種丁香酚類物質，考察濃縮至干與濃縮至近干（剩余約0.2 mL）對6 種化合物回收率的影響。結果顯示當濃縮至近干時，6 種丁香酚類物質的回收率均在97.2%以上；而濃縮至干時，6 種丁香酚類物質回收率均有所下降，在69.8%～87.1%之間（表2）。因此，應注意在濃縮過程中不能濃縮至干，但在實際操作過程較難控制，于是采用在濃縮前加入100 μL高沸點的二甲亞砜，從而有效避免濃縮至干對結果的影響。

表2 濃縮程度對丁香酚類物質回收率的影響Table 2 Effect of concentration level on recovery of eugenols

2.3 方法學考察結果

2.3.1 線性范圍與定量限

以6 種丁香酚類物質的峰面積作為Y軸，質量濃度（ng/mL）作為X軸計算線性回歸方程。由表3可以看出，在1.0～500 ng/mL范圍內，6 種丁香酚類物質線性關系較好，相關系數（R）在0.99以上，檢出限為0.1～0.3 μg/kg之間，定量限在0.3～1.0 μg/kg之間，滿足分析需求。

表3 丁香酚類物質的線性關系和定量限Table 3 Calibration curves and limits of quanti fication (LOQs) of eugenols

2.3.2 準確度與精密度

表4 丁香酚類物質的準確度、精密度和回收率Table 4 Accuracies, precisions, and recoveries of eugenols

分別以陰性明蝦、鱸魚、蟹為基質，進行添加水平為2.00、5.00、10.0 μg/kg的加標回收實驗，每種加標水平平行實驗6 次。如表4所示，6 種丁香酚類物質在3 種基質中平均回收率在83.9%～105.4%之間，相對標準偏差在1.8%～6.9%之間，表明該方法檢測水產品中丁香酚類物質殘留量準確可靠，精密度好，符合痕量分析要求。2.3.3 基質效應

分別以陰性明蝦、鱸魚、蟹為基質，得到3 種基質的空白基質溶液，分別加入混標中間液配制成質量濃度均為4.00、10.0、20.0 ng/mL的基質標準溶液，并與同質量濃度的標準溶液（10%乙腈配制）一起上機測試，標準溶液所得的各物質峰面積為A1，基質標準溶液所得各物質的峰面積為A2，基質效應/%=A2/A1×100，結果見表4，3 種基質對丁香酚和異丁香酚均表現出基質增強（基質效應＞100%），而對其余4 種化合物則表現出一定程度的基質抑制（基質效應＜100%），6 種化合物的基質效應在89.8%～111.6%之間，符合分析要求。

2.4 實際樣品測定結果

利用本方法調查了市場上明蝦、鱸魚、蟹、羅非魚、黃瓜魚、麗魚等共計68 份樣品中丁香酚類物質的含量，結果發現15 份樣品檢出丁香酚，含量在1.2～4 574 μg/kg之間，檢出率為22.1%，其余5 種化合物均未檢出；按日本相關標準的限量值50 μg/kg計，有9 批次不合格，不合格率為13.2%；若按美國和加拿大相關標準計，則不合格率達到22.1%，可見我國水產品中丁香酚類物質殘留問題的嚴重性。

3 結 論

本實驗采用UPLC-MS/MS法，結合固相萃取技術，建立水產品中6 種丁香酚類物質的同時快速測定方法，外標法定量，并對相關條件進行優化。該方法簡便、檢出限低、重復性好、準確度高，且將所建立的方法應用于實際樣品的測定，發現丁香酚檢出率較高，國家相關部門應對水產品中丁香酚類物質殘留進行風險監測，對水產品中丁香酚類物質殘留進行污染調查研究，并進一步對丁香酚的代謝周期以及毒理學進行研究。