元素指紋圖譜用于安化黑茶的原產地判別

楊 純，顏鴻飛，呂小園，陸 靜，賀 鵬

（長沙海關技術中心，湖南 長沙 410004）

湖南安化黑茶因其具有上乘的特殊保健功效如降脂減肥、改善消化道、防癌抗癌等和深厚的文化底蘊而迅速發展和興起，其獨特的制作工藝已列入國家級非物質文化遺產。安化黑茶已獲得中國馳名商標和地理標志產品保護的稱號，深受消費者喜愛[1]。近幾年市場上出現部分外路劣質茶（非正宗安化黑茶）加工成“安化黑茶”，大大影響了購茶者的消費信心，給湖南安化黑茶的聲譽帶來了嚴重影響。目前，安化黑茶的鑒別主要靠業內人士憑感官經驗進行鑒別，沒有系統有效的區分方法。現有保護安化黑茶的標準和公告等因其可以依據的理化成分指標較少且簡單，難以將安化黑茶與其他產地黑茶區分開來。為了保護安化黑茶品牌，使地理標志產品、名優特產品的健康發展，需要使用科學的技術手段進行鑒別和區分檢測，所以開發出一種湖南安化黑茶的產地溯源與鑒別方法成為必要[2-3]。

產地溯源旨在探尋表征不同地域來源產品的特異性指標[4-9]。茶葉品質與其產地的氣候條件及加工方法有密切關系，不同產地茶葉中礦質元素含量存在一定的差異性[10-14]。近些年來，國際上應用礦物元素分析技術在產地溯源方面取得了較好的成果。Marcos[15]、Fernández-Cáceres[16]、Moreda-Pi?eiro[17]等用電感耦合等離子體原子發射光譜、電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）對來自不同國家茶葉分別進行元素分析及產地溯源，可成功將中國茶葉與其他國家茶葉區分。近些年來，礦質元素指紋圖譜分析技術在產地溯源方面取得了較好的成果[18-21]。現代儀器分析技術已經成為比較新型的茶葉分類、品質鑒定方法[22-23]。

本實驗應用ICP-MS高通量光譜檢測技術對湖南安化黑茶、云南普洱茶、廣西六堡茶和湖北青磚茶共49 個茶葉樣品中B、Li、P等48 種元素組分進行定量分析，得到黑茶元素指紋圖譜，找尋有效區分識別湖南安化黑茶原產地特征元素指標，建立對湖南安化黑茶產地來源進行判別分析模型，以期為制定湖南安化黑茶可量化的原產地判別標準以及摻假識偽提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取不同產地的49 個黑茶樣品進行研究，其中湖南安化黑茶22 個樣品，購自湖南安化縣茶廠；云南普洱茶樣品13 個，廣西六堡茶樣品8 個，湖北青磚茶樣品6 個，購自湖南茶葉市場，茶葉樣品具體信息見表1。

硝酸（優級純）；超純水；茶葉標準物質（GBW10083） 國家標準物質研究中心；48 種元素的標準溶液（1 000 μg/mL） 中國計量科學研究院。

表1 茶葉樣品Table 1 Geographical origins of tea samples tested in this study

1.2 儀器與設備

iCAP Q型ICP-MS儀 美國賽默飛公司；MARS6 Onetouch型高壓微波消解器 美國CEM公司；ML204型分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線繪制

用5%稀硝酸溶液將48 種1 000 μg/mL的標準溶液逐級稀釋配成以下質量濃度：P、Al、K、Ca、Fe、Mg、Na質量濃度為100、500、1 000、3 000、5 000 μg/L；Cu、Ti、Mn、Rh、Zn、Sr質量濃度為10、50、100、300、500 μg/L；B、Li、Be、As、Cd、Pb、Ga、V、Cr、Rb、Co、Ni、Se、Sn、Te、Mo、Cs、Sb、Ba、Tl、Tm、Yb、Ho、Er、Tb、Dy、Gd、Eu、Sm、Nd、La、Ce、Pr、Y、Lu質量濃度為1、5、10、30、50 μg/L。

1.3.2 內標溶液配制

用5% HNO3溶液將1 000 μg/mL的Sc、Ge、In、Bi、Re標準溶液逐級稀釋為50 μg/L混合內標溶液。

1.3.3 元素含量測定

實驗中所用的茶葉樣品用食品攪拌機打碎，過60 目篩，貯存于塑料試樣袋中。將樣品于（103±2）℃（設定值103 ℃）烘干至質量恒定，用樣品袋密封后放置于干燥器中保存待用。稱取烘干茶葉樣品約0.5 g（精確至0.000 1 g）置于四氟乙烯消化管內，加入5 mL硝酸，浸泡過夜，然后放入高壓微波消解儀內進行消解，程序如表2所示。樣品消解完全后取出，置于趕酸裝置中于180 ℃趕酸，當消解液剩余約0.5 mL停止趕酸，冷卻，將樣品轉移至25 mL容量瓶中，用水定容，搖勻，待測。隨同制備樣品空白溶液。將標準曲線、樣品空白溶液、樣品溶液依次導入ICP-MS進行元素含量測定，具體ICP-MS儀器參數見表3。

表2 微波消解程序Table 2 Optimal procedure of microwave digestion

表3 ICP-MS工作參數Table 3 Operating parameters of ICP-MS

1.4 數據處理

運用IBM SPSS Statistics 19和SIMCA P 11.5軟件進行數據的變量篩選、主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）等統計分析。

2 結果與分析

2.1 茶葉標準物質測定結果

按照本法對國家標準物質樣品茶葉（GBW10083）中14 種元素進行6 次平行測定，結果見表4。表明本方法的測定值與茶葉標準物質樣品標準值具有良好的一致性，樣品前處理和儀器測定準確度均符合實驗分析要求。

表4 茶葉標準物質測定結果Table 4 Certi fied and measured values of 14 elements in tea reference material

2.2 顯著差異元素分析

表5 不同產地黑茶樣品的48 個元素含量Table 5 Contents of 48 elements in Anhua dark tea from different geographical origgiinnss

不同產地黑茶中48 種元素含量測定結果見表5。黑茶中所有含的元素含量差異很大，K含量很高，均在15 000 mg/kg以上。P、Al、Ca、Mn、Mg含量在1 000～6 700 mg/kg之間，Te和Lu未檢出，不同產地黑茶元素含量也各有其特征。云南和廣西由于地理位置較近，所測元素含量都較接近，數據顯示僅Rb、Co、Mo、Cs、Na、Tl、Ce在兩地間的差異區分較為明顯。4 個產地黑茶中湖北產地黑茶所測的元素含量大部分偏高，如Al、Pb、Ca、Ti、V、Cr、Mn、Fe等，原始數據顯示每個省份平均含量差異顯著的元素有Pb、Li、Ce、Ba、Gd、Ga等，對于組間類別區分較明顯。進一步對48 種元素含量進行單因素方差分析，結果顯示，在α=0.05水平上有顯著差異的變量元素19 種，分別為Li、Pb、Ga、V、Cr、Fe、Rb、Mo、Cs、Sb、Ba、Na、Tl、Gd、Sm、Nd、La、Ce、Pr。

2.3 PCA結果

表6 主成分的方差貢獻率Table 6 Eigenvalues and contribution rates to total variance of principal components

圖1 黑茶樣品的主成分得分投影圖Fig. 1 PCA score plots of dark tea samples

主成分得分投影圖能夠直觀地反映樣本間的相似或差異性，能夠進行各類樣本的分布規律、品種分類、產地溯源和品質分級等研究[24,27]。本實驗為得到黑茶樣品的產地類別聚集趨勢規律及特征，對49 個茶葉樣品和19 種顯著性差異元素含量的標準化數據進行PCA，得到前5 個主成分累計貢獻率為88.441%，其中第1主成分貢獻率為53.906%，前2 個主成分累計貢獻率為68.964%，結果見表6。進一步運用SIMCA P 11.5進行PCA，得到以湖南安化黑茶和其他產地黑茶在PC1和PC2上的主成分得分投影圖（圖1）。由圖1可知，安化黑茶和其他產地黑茶樣品二維空間中的分布呈現出較好的類別聚集趨勢。

2.4 PLS-DA結果

PLS-DA法可以消除相互重疊的數據信息，尤其是當自變量個數大于觀察量個數時，其數據分析結果更加準確可靠[26]。為尋找更為有效的安化黑茶識別分析方法，本實驗利用PLS-DA進行判別分析，通過每個樣本點在PLS-DA得分圖上的相對位置和分布情況顯示樣本的分類信息，從而達到樣品識別的目的。本實驗將49 個茶葉樣本和19 個顯著性差異元素含量的標準化數據作為變量，建立數據矩陣，根據茶葉產地信息的4 個類別即類別1（湖南安化黑茶）、類別2（云南普洱茶）、類別3（廣西六堡茶）和類別4（湖北青磚茶），進行PLS-DA，所得PLS-DA圖，見圖2。湖南安化黑茶分布比較集中，云南普洱茶分布較為分散，廣西和云南地域接近，茶葉特征（元素含量分布特征或指紋特征）較為接近，有部分交叉現象。但是湖南安化黑茶與其他產地黑茶類別聚集明顯，都較為集中地分布在各自特征區域，能夠很好地將湖南安化產地黑茶與其他產地茶進行識別。

圖2 湖南安化黑茶與其他產地茶葉的PLSS--DDAAFig. 2 PLS-DA plot of Hunan Anhua dark tea and those from other regions

2.5 逐步判別分析

從茶葉樣品中各元素指標的方差分析、PCA和PLS-DA結果可以看出，利用元素指紋圖譜分析技術對湖南安化黑茶的原產地判別可行。為進一步了解各元素含量對黑茶產地的判別情況，對19 種特征元素含量的標準化數據按照統計量Wilk's λ最小值原則選擇變量，進行逐步判別分析，建立判別方程。結果顯示Li、Pb、Ga、Ce、Rb、Cs和Na 7 種元素先后被引入判別模型中，所建立的判別模型如下：

類別1（湖南安化黑茶）=－5.274－0.406（Li）－5.371（Pb）+6.173（Ga）－1.480（Ce）－5.052（Rb）－4.513（Cs）－1.201（Na）

類別2（云南普洱茶）=－10.139－10.639（Li）+2.742（Pb）－5.568（Ga）+0.050（Ce）+3.463（Rb）+0.288（Cs）+3.846（Na）

類別3（廣西六堡茶）=－33.465+0.228（Li）+6.700（Pb）－12.156（Ga）－3.591（Ce）+17.773（Rb）+11.232（Cs）+2.167（Na）

類別4（湖北青磚茶）=－16.329－4.953（Li）+10.681（Pb）－6.363（Ga）+12.182（Ce）－4.213（Rb）－1.005（Cs）－0.239（Na）

利用此模型對樣品進行歸類，進行回代檢驗和交叉驗證分析（表7），回代檢驗判別率為100%，交叉驗證判別率為98%，說明Li、Pb、Ga、Ce、Rb、Cs和Na這7 種元素指標對黑茶產地判別效果好。熟度較高，且礦物質集中的成熟葉、莖、梗一同作為原料發酵，礦質元素含量比其他茶類較高。黑茶原料黑毛茶采摘的時節、級別、樹種等對茶葉的元素含量也存在影響。再次，可能與安化黑茶獨特的加工工藝有關。安化黑茶最具特征的工序是在初制進程中的“渥堆”發酵工序與“松柴明火”干燥工序及在精制過程中“渥堆”等過程，都對茶葉元素含量都存在一定的影響。總之，茶葉元素含量指紋特征是土壤環境、工藝、原料、茶樹等多種因素的綜合影響結果。因此，需要進一步研究分析安化黑茶的產地土壤環境、原料品種、加工工藝、茶樹種類等對黑茶元素含量的影響，才能更加系統闡述和探究安化黑茶礦物質元素指紋特征的形成原因，為安化黑茶的產地溯源分析提供理論基礎和技術參考。

表7 黑茶產地判別分析Table 7 Classi fication with discriminate analysis of dark tea samples

4 結 論

3 討 論

本研究采用ICP-MS法得到湖南安化黑茶的元素含量指紋圖譜信息，能夠較好地表征安化黑茶原產地特征。不同產地黑茶樣品微量元素種類基本相同，但一些元素含量差異顯著。各產地黑茶有著各自的特征元素，相鄰地區樣品元素含量和特征元素相近，如湖南與湖北黑茶元素含量較為接近，云南與廣西黑茶元素含量相近。安化黑茶中微量元素種類較豐富，其中含量較高最具代表的礦物元素為P、Cu、Al、K、Cr、Ca、Mn、Fe、Zn、Ba、Na、Mg，其中Zn、Mn、Cu為超氧化物歧化酶的構成元素，具抗氧化作用，含量分別高達35.529、1 471.8、19.039 mg/kg，對人體健康大有益處；稀土元素的含量較低，如Cs、Gd、Sm、Nd、La、Ce、Pr等，過量的稀土元素會影響茶葉的品質危害人體健康[28-29]。與其他產地黑茶存在明顯差異的特征元素為稀土元素（以Ce為突出代表，以及Cs、Gd、Sm、Nd、La、Pr等），以及被引入判別模型的堿金屬元素Li、Na、Rb、Cs。安化黑茶以上顯著性元素特征可能與安化縣茶葉生長土壤相關。安化縣內土壤以板頁巖風化發育的土地面積最廣，茶園土質較好，土壤以酸性和弱性為主，酸堿度適宜，養分含量較高[30]。這些特征元素能夠較好地表征安化黑茶原產地特征，可以作為鑒別安化黑茶產地的重要技術指標。

“安化黑茶”作為地理標志保護產品，主要指產自于湖南省安化縣內特定生長區域，采用安化雪峰山脈茶區的大葉種群體品種為原料，經過四大復雜的工藝加工而成，具有明顯的地域性[30]。首先植物中礦物元素含量特征與其產地環境中礦質元素的含量密切相關。安化黑茶元素含量與安化地域獨特的地理位置和土質有關，氮、鉀和硒等有機質含量豐富。其次，可能與安化黑茶的加工原料黑毛茶有關。安化黑茶采制原料黑毛茶的成

本實驗采用ICP-MS對安化黑茶及其他產地黑茶中的B、Li、P等48 種元素組分進行定量分析，得到黑茶元素指紋圖譜。利用方差分析得到具有顯著性差異的元素有Li、Pb、Ga等19 種，云南和廣西由于地理位置較近，所測元素含量都較接近，4 個產地黑茶中湖北產地黑茶所測的元素含量大部分偏高；利用PCA和PLS-DA對湖南安化黑茶與其他產地黑茶類別進行判別分析，得到主成分得分投影圖和PLS-DA圖，各個產地的黑茶樣品在各自特征區域聚集較明顯，能對湖南安化黑茶與其他原產地黑茶進行有效區分和識別；采用逐步分析得到4 個產地判別模型，其中被引入產地判別模型的元素有7 種，依次為Li、Pb、Ga、Ce、Rb、Cs和Na，所建立的判別模型對樣品回代檢驗判別率為100%，交叉驗證判別率為98%。結果表明基于元素指紋圖譜結合化學計量學統計方法對湖南安化黑茶的原產地判別可行。