熱轉換元素分析-同位素比質譜法測定低氘包裝飲用水中氘含量

韓 莉，劉 迪，余婷婷

（湖北省食品質量安全監督檢驗研究院，湖北 武漢 430074）

自然界的水中，氘含量約為150 μg/g（δ2H：－37‰）。研究表明，氘對生命體的生存和繁衍有害，可以導致衰老、病變、癌變等[1-3]。含氘量偏低的低氘水能影響細胞分化過程[4]，具有一系列的生物學效應，如抗腫瘤、抗氧化、防衰老、抗輻射、降血壓、保護心血管系統等，在保健品、化妝品以及醫學領域具有很大應用價值[5]。自然界中的低氘水主要以冰川水的形式存在，氘含量約為130 μg/g（δ2H：－165‰），實驗室可以通過同位素真空蒸餾法制備氘含量為20～110 μg/g（δ2H：－871‰～－294‰）的低氘水[6-7]。目前，國內市場已有一些廠商加工生產了不同規格純天然和人工低氘包裝飲用水產品，價格昂貴，原料水產地各異，標簽標識氘含量為25～146 μg/g（δ2H：－839‰～－60‰），這些產品已經在市場和網絡電商平臺上廣泛流通，有些產品已成為癌癥病人的輔助治療飲用水。

目前我國關于低氘水中氘含量測定的研究較少，尚無對此類包裝飲用水的氘含量定量分析的國家標準檢測方法，使得低氘水的生產和銷售市場監管缺乏技術支撐。水中氘同位素測試主要是金屬還原法[8-10]和H2-H2O平衡法[10-12]。低氘水中的氘含量分析需要通過前處理將液態水中的氘轉化為氣態，然后通過檢測儀器進行定量分析，一般有氣相色譜法，質譜法、核磁共振法。氣相色譜法用金屬鎂在500 ℃高溫下將超輕水分解為氣體，然后高溫下以高純H2為載氣，分子篩作為色譜柱，進行超輕水中氘含量的檢測[13]；質譜法采用疏水鉑催化H2-H2O平衡法以及穩定同位素質譜儀作為低氘水中氘定量檢測方法，測試相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在1%以內[14]；核磁共振法利用氫、氘譜結合對氘元素進行定量檢測，國內鮮見報道。上述方法存在記憶效應明顯、成本高、用樣量大、對反應溫度穩定性要求高等缺點，普適性不強。因此，建立一種高精度、高準確度、高穩定性、低成本的測試方法滿足低氘包裝飲用水中氘含量的分析測定十分必要。

同位素質譜（isotope ratio mass spectrometry，IRMS）分析技術在食品真實性鑒別和來源解析方面有較廣泛的應用[15-18]，碳還原高溫熱轉換原理的測試技術可以用于固體和液體樣品中碳、氮、氫、氧、硫等穩定同位素組成的測定[18-22]。經過不斷建立和完善，熱轉換元素分析（thermal conversion/elemental analysis，TC/EA）-IRMS測定水中氘同位素技術已經比較成熟[23-25]。劉運德等[24]采用熱轉換元素分析同位素比質譜法實現了在線單次分析過程中測定微量水中δD和δ18O，用樣量僅需0.2 μL，氘的測試精度為0.81‰。楊斌等[25]采用TC/EAIRMS法對不同品牌飲用水中氫同位素δD進行測定，并比較了該方法與水平衡-同位素比質譜法測定值的差異（0.6±1.59）‰。本實驗將采用TC/EA-IRMS技術對低氘包裝飲用水中的氘同位素值比值δD測定適用性進行分析評價，根據氘同位素比值理論公式計算得到氘含量，建立低氘包裝飲用水中氘含量的測試方法，以期為低氘包裝飲用水品質和真實性的監測和管控提供有效的理論依據，保障人民健康和消費者權益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

He、H2（純度≥99.999%） 武漢紐瑞德貿易有限公司；VSMOW維也納平均海洋水（δ2H：0‰）、GISP格林蘭冰雪融水（δ2H：－189.5‰） 國際原子能機構；貧氘水（氘含量＜1 μg/g） 美國Sigma公司；礦泉水為市售農夫山泉礦泉水；超純水為實驗室自制。

1.2 儀器與設備

TC/EA-IRMS聯機系統（Flash 2000HT元素分析單元、Conflo IV連續流接口裝置和DELTA V Advantage穩定同位素比質譜儀聯合組成）、AS3000液體樣品自動進樣器 美國Thermo Fisher Scienti fic公司；激光液態水穩定同位素分析儀 美國LGR公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備與貯存

標準水樣和樣品水樣密封保存在4 ℃冰箱，取樣前拿到測試房回至室溫，樣品瓶打開后立即取樣，剩余標準水樣和樣品水樣轉移至玻璃頂空瓶，用壓蓋器將頂空瓶蓋壓緊，封口膜密封，置于4 ℃冰箱保存。

1.3.2 測試方法

采用0.22 μm微孔濾膜過濾樣品適量，移取2 mL水樣裝滿進樣瓶，用內襯有密封隔墊的螺旋孔蓋密封，進樣瓶內不留頂空。自動進樣器進樣體積0.1 μL，反應爐溫度1 380 ℃，柱溫箱溫度85 ℃，載氣He流速100 mL/min。每個水樣進行4～6 次分析。液態水在液體進樣器進樣口氣化，由He引入玻璃化碳管（填料為表面粗糙的玻璃碳），高溫條件下裂解為H2和CO，在氣相分離單元分離后進入DELTA V質譜主機。H2在真空條件下電離產生[H2]+和[HD]+離子束，并在聚焦磁場中分離進入特定的法拉第接受杯，再由不同電阻值的放大器轉化為電信號，完成δ2H的測試。

1.3.3 實驗設計

1.3.3.1 記憶效應對結果的影響實驗

為了驗證方法中記憶效應對測定結果的影響，對自來水、凈化水、礦泉水、VSMOW、GISP、DDW-1、DDW-2、DDW-3進行氫同位素分析。其中DDW-1～DDW-3為低氘包裝飲用水樣。

1.3.3.2 頂空體積對測定結果的影響

分別取0.5、1、2 mL（不留頂空）VSMOW標準水樣于2 mL進樣樣品瓶，旋緊螺旋孔蓋（孔蓋不要擰過緊），分別對3 瓶水樣進行氫同位素測試。

1.3.3.3 氘含量測定范圍確證

用貧氘水（＜1 μg/g，可忽略不計）稀釋VSMOW標準水樣至氘含量范圍15.571～155.760 μg/g，稀釋GISP標準水樣至氘含量范圍12.624～126.243 μg/g，對稀釋后的VSMOW和GISP標準水樣進行氘含量測試。

1.4 氘含量測試和計算原理

TC/EA-IRMS法測定水氫同位素比值的基本原理：在高溫條件下，水與碳粒迅速反應，定量生成H2，然后在He載氣攜帶下經恒溫色譜柱分離，反應式見式（1），分別導入同位素比質譜儀的離子源內，順序測定水的穩定氫同位素組成，與參考物質比較得出水中氫穩定同位素比值（2H/1H），并以千分差的形式表達（δ2H/‰）。由于進樣針取水樣時會存在交叉污染，因此需注意消除記憶效應對實驗結果的影響，同時進樣瓶中的空氣與水樣會發生氫交換而產生氫同位素分餾，氫穩定同位素比值測試過程需要防止空氣中的水分對IRMS測定的干擾。

通過公式計算水中氘含量X（D）推算原理如下：

水中穩定氫同位素比值計算如式（2），可用式（3）表示：

式中：RVSMOW＝155.76×10－6，為國際公認數據，表示維也納標準平均海洋水中氘同位素和氕同位素摩爾百分含量之比。

如式（4）所示，水中氫同位素比Rsample為氘同位素摩爾百分含量X（D）與氕同位素摩爾百分含量X（H）之比，其中X（D）+X（H）＝1，因此式（4）可轉換為式（5）：

2 結果與分析

2.1 系統穩定性

IRMS系統的性能優劣是確定水轉化的H2中氫穩定同位素比值能否被認可的重要指標。驗證IRMS系統的測定穩定性，連續10 次通入固定體積的高純H2氣體，測定H2中δ2H，結果見表1。其標準偏差（standard deviation，SD）為0.192‰，穩定性較好。

表1 IRMS系統穩定性Table 1 Stability of IRMS system

2.2 記憶效應對水δ2H測定影響

圖1 TTCC/EA-IRMSS 測 試水中δ2H值記憶效應Fig. 1 Schematic diagram of δ2H value memory effect in TC/EA-IRMS testing

如圖1所示，8 個水樣的第1次測定值受前一次測試的影響而產生了記憶效應，相對于參考氣δ2H值比較偏負的GISP和DDW-3受記憶效應影響較大。以VSMOW剔除數據后的δ2H值SD變化為例，分別剔除1～3 個數據點，SD值變化如圖2所示，剔除第1個點，SD可由1.31‰減小至0.54‰，剔除2 個點可降至0.35‰，再繼續剔除其SD已無明顯變化。剔除圖1中每個水樣測試的第1個數據點，處理得到的結果如圖3所示，記憶效應消除明顯。

圖2 剔除數據點數與VSMOW δ2H測定值SSDD變化Fig. 2 Relationship of SD value of VSMOW δ2H with removal of data points

圖3 記憶效應消除后水中δ2HH值Fig.3 δ2H values in waters after memory effect was eliminated

為了消除記憶效應，可以將水樣在分析測試之前進行預測并分類，按氫同位素組成接近的水樣歸為一批次，將氫同位素組成接近的水樣進行同批次測試；水樣分析前，用待測水樣清洗進樣針至少3 次；對每個水樣進行多次測試分析（不少于4 次），剔除第1～2個數據后取平均值作為最終結果。

2.3 樣品瓶頂空體積對水δ2H測定影響

水的蒸發會產生氫同位素分餾[26-27]，考慮到空氣中水分子的氫可能與水樣中的氫發生交換而使得水樣中的氫產生同位素分餾，影響水δ2H值測試的準確性。本研究設計了對照實驗，考察樣品瓶頂空體積對實驗結果的影響。如圖4所示，頂空體積對測試值有較小的影響，但是在短期內影響不明顯。考慮到水樣測試時間可能較長，盡可能將水樣充滿進樣瓶不留頂空，減少與空氣的接觸，樣品更加穩定，測試精度也更高。

圖4 樣品瓶頂空體積對VSMOW水樣影響Fig. 4 Effects of vial headspace volume on SD of VSMOW δ2H

2.4 TC/EA-IRMS測試低氘包裝飲用水氘含量的范圍確證

低氘水中氘含量極低，一般低于150 μg/g，由式（6）換算即為δ2HVSMOW值為－36.980‰，目前市面上氘含量低至25 μg/g的δ2HVSMOW值為－839.497‰，氫同位素比值差值達802.517‰，為驗證該方法對低氘水氫同位素比值極負以及較寬范圍適用性，設計了相關系列實驗，測試結果見表2。VSMOW和GISP標準水樣在經過貧氘水稀釋后，氘含量測定值與理論值相差范圍為0.007～0.618 μg/g。TC/EA-IRMS測試超輕水氘含量在12.624～155.760 μg/g范圍內較準確，測量值與理論值的RSD＜0.6%。

表2 貧氘水稀釋的不同氘含量標準水樣測試結果Table 2 Results of standard water samples diluted with deuteriumdepleted water with different deuterium contents

如圖5所示，VSMOW和GISP標準水樣經不同倍率稀釋后稀釋倍數和氘含量線性關系很好，線性相關系數均高達1。進一步說明標準水樣中氘分布均勻，經氘含量低于1 μg/g的貧氘水按比例稀釋后氘含量測定很準確，TC/EA-IRMS法適用于氫同位素比值極負的水樣中氘含量的測定。

圖5 標準水樣不同稀釋倍數和其氘含量測定值線性關系圖Fig. 5 Linear relationship between dilution factor and deuterium content

2.5 不同單點校正方式對結果的影響

水δ2H值表示樣品2H/1H測定值相對于VSMOW2H/1H測定值的千分差，對于貧氘水稀釋的GISP水樣，分別進行VSMOW標準水樣單點校正（校正1）、實驗室配制的與不同稀釋比例GISP水樣δ2H值接近的VSMOW標準水樣單點校正（校正2），結果見表3，氘含量的值由式（6）換算得到，直接由VSMOW對GISP稀釋水樣進行單點校正，其δ2HVSMOW測定值與參考值SD高達2.785‰，如果用實驗室稀釋的VSMOW標準水樣校正GISP水樣（稀釋后VSMOW水樣和GISP水樣δ2H差值小于100‰），δ2HVSMOW測定值與參考值的SD明顯減小，采用校正2的方式得到的氘含量測定值與參考值SD也明顯減小，但校正1方式下得到的氘含量測定值也在精度允許范圍內。總之，校正方式對氫同位素比值范圍較廣的水氫同位素比值測定影響較大，最好采用校正標準水樣和樣品水樣的δ2H差值小于100‰，氘含量的定量分析與校正方式的選擇得到結果的偏差可以忽略不計。

表3 氫同位素分析結果校正方法對比Table 3 Comparison of correction methods for hydrogen isotope analysis resuullttss

2.6 方法穩定性

按照上述樣品處理方式和儀器運行程序，連續8 次測定同一瓶低氘包裝飲用水的δ2H值見表4，剔除第1個點后得到δ2H值的SD為0.548‰，經計算得到的氘含量值SD為0.085 μg/g，重復性較好。

表4 水樣δ2HVSMOW值Table 4 δ2HVSMOW values of water sampless

在30 d內分3 次測定質控水樣中δ2H，測試值在－59.102‰～－60.804‰內波動，SD為0.55‰，δ2H值在15 d內較穩定，超過30 d后值趨向偏正，但在誤差允許范圍內。氘含量146.639～146.289 μg/g范圍內波動，SD為0.086 μg/g，說明該方法測定低氘水中氘含量再現性良好。

2.7 低氘包裝飲用水樣品測定結果

選用市場售賣的低氘包裝飲用水樣品8 個按照本法進行測試，采用上述校正2的方式對測試結果進行校正，氘含量值由式（6）換算得到。如表5所示，所選水樣均為氘含量低于150 μg/g的低氘水，8 個樣品氘含量測定值SD范圍0.041～0.218 μg/g，重復性較好。與標識值比較，按照本研究方法測定的低氘包裝飲用水中氘含量不合格率可達50%。低氘水的飲用可以使得人體血液中的氘含量降低，可能增強生命體抗氧化性、新陳代謝、抗癌性等[28]，有研究表明，水中氘含量越低，癌細胞增殖抑制越明顯[29-30]。低氘水對人的身體益處很大，因此商家會需要氘含量更低的水謀取更多利潤，人工低氘飲用水氘含量越低，生產成本越高，#1、#3、#5、#6就是氘含量未達標的假冒偽劣產品典型。

表5 低氘包裝飲用水氘含量測定值Table 5 Measured values of deuterium content in packaged drinking water labeled low deuterium

2.8 不同方法測定低氘包裝飲用水氘含量驗證

選取貧氘水稀釋的VSMOW和GISP水樣以及低氘包裝飲用水樣，采用激光液態水穩定同位素分析儀測定水樣中δ2H值并計算得到氘含量值見表6，經2 種方法測定得到的δ2H值計算得到的氘含量SD值隨著水樣氘含量降低而呈現增大趨勢，在氘含量較低的時候存在一定的差異性，但是均低于1 μg/g，在誤差允許范圍內。因此，2 種儀器測定低氘飲用水中氘含量結果一致。

表6 不同方法測定氘含量結果Table 6 Results of determination of deuterium content by different methods

3 結 論

建立了TC/EA-IRMS同位素質譜測定低氘水中氘含量的分析方法，適用于低氘包裝飲用水中氘含量的測定。該法測定低氘飲用水中氘含量用樣量少、前處理簡單、結果穩定性和再現性好、記憶效應可明顯消除。由于缺乏氘含量極低的標準水樣，本研究采用貧氘水（氘含量＜1 μg/g）稀釋的標準水樣校正與其氘含量接近的低氘水樣，該法比傳統的單點校正得到的結果準確度更高。采用TC/EA-IRMS法對市售低氘飲用水中氘含量進行測定分析，測定值與標識值不相符的現象明顯，說明流通市場上的低氘包裝飲用水監管存在很大問題，相關檢測方法和法律法規亟需研制建立。TC/EA-IRMS測定水中氘含量方法的建立可以為低氘水這類包裝飲用水品質和真實性進行有效的監測和管控提供技術支撐，謹防不法商販以次充好，保障消費者的權益。