鮮食玉米發(fā)育過程中游離糖和氨基酸變化

牛麗影，李大婧，劉春泉，宋江峰,*，陳計巒，陳艷萍，袁建華

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 823003；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，江蘇 南京 210014）

鮮食玉米發(fā)育可分為吐絲期、籽粒建成期、乳熟期、蠟熟期、完熟期等階段[1]。在不同的發(fā)育階段有不同的食用方式，如玉米筍是指剛剛抽絲、尚未鼓粒的幼嫩果穗，穗粒同食[2]；鮮食玉米則以吐絲授粉后發(fā)育20 d左右的乳熟期籽粒為食用部位[3-5]。無論是玉米筍還是玉米籽粒，甜味都是鮮食玉米重要的風(fēng)味特色。據(jù)研究，甜玉米中甜味與糖含量尤其是蔗糖含量顯著相關(guān)，并對消費者的整體嗜好性起了至關(guān)重要的作用[6]，因此依據(jù)發(fā)育過程中糖含量變化規(guī)律確定甜玉米的鮮食適采期已多有報道[3-5]。在中國，糯玉米是除甜玉米之外的另一種重要的鮮食玉米類型，在格局上有“南甜北糯”之說。但糯玉米中糖含量的報道更多以可溶性糖表示[3]，難以判斷是否可參考甜玉米的甜味評價方式。除糖外，游離氨基酸為公認的呈味物質(zhì)，如甘氨酸和丙氨酸呈甜味，谷氨酸對鮮味有重要貢獻，在番茄[7]、蘑菇[8]等食材中得到廣泛研究。但是，有關(guān)鮮食玉米中游離氨基酸的研究較少，Masuda等[9]對幾種甜玉米中的游離氨基酸分析發(fā)現(xiàn)谷氨酸和丙氨酸的含量（鮮質(zhì)量）分別為70～120 mg/100 g和80～100 mg/100 g，高于水溶液中鮮味和甜味的感官閾值。另有研究表明[10]，鮮食玉米汁中游離糖和氨基酸因胚乳類型的不同可高于或低于感官閾值，但對發(fā)育過程中糯玉米游離氨基酸變化則鮮見報道。

除作為重要的滋味成分外，糖和氨基酸還作為食品風(fēng)味物質(zhì)或有害物質(zhì)的前體物[11-12]被廣泛報道，還有的氨基酸因生理調(diào)節(jié)作用而被關(guān)注[13-14]。鮮食玉米因多汁味美的特征，也往往被加工成飲品[15]，幾十年來始終能在多變的飲料市場占據(jù)一席之地。但是，以往研究多圍繞玉米的鮮食特性或玉米汁工藝配方開展，在玉米的適宜制汁發(fā)育期、適宜性上缺乏必要數(shù)據(jù)。因此本實驗分別選取甜玉米和糯玉米2 種鮮食玉米，采取高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對吐絲授粉始至乳熟期玉米筍或籽粒中的游離糖和氨基酸含量進行測定，并基于主成分分析與聚類分析結(jié)果，對發(fā)育階段和品種間的差異進行比較，以期為鮮食玉米加工尤其是制汁原料選擇、風(fēng)味變化和工藝研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮甜玉米晶甜5號和糯玉米晶糯8號采自江蘇省南京市六合區(qū)試驗基地。晶甜5號采樣自授粉后第1天開始，每隔3 d采一次，直至授粉后28 d，記為S-1、S-4…S-28共10 個采收期；晶糯8號由授粉后第3天開始采收至25 d，記為W-3、W-7…W-25共8 個采收期。每次采收鮮穗當(dāng)日運至實驗室，手工分離完整籽粒并用液氮速凍后－20 ℃凍藏，授粉后10 d及更早采收的樣品則以玉米筍形式凍藏。

葡萄糖、果糖、蔗糖 上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；硼酸緩沖液 南京化學(xué)試劑公司；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、溶于0.1 mol/L鹽酸的氨基酸混合標準溶液（含24 種氨基酸） 上海Sigma公司；谷氨酰胺（純度≥99%）、天冬酰胺、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、3-巰基丙酸 上海阿拉丁試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1200型HPLC儀（配備二級管陣列檢測器（photodiode-array-detector，DAD）與示差折光檢測器（refraction index detector，RID）） 美國安捷倫科技有限公司；RE52CS真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 游離糖的測定

參考文獻[16]方法，并略有改動。冷凍玉米筍或籽粒剪刀剪碎后取5.0 g，加入50 mL體積分數(shù)80%的乙醇溶液，研缽內(nèi)勻漿后4 000×g離心10 min，沉淀用15 mL 80%乙醇溶液潤洗離心2 次。上清液合并后用80%乙醇溶液定容至100 mL，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，用蒸餾水定容至20 mL，10 000×g離心10 min，取上清液待測。色譜條件為：Carbohydrate色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），RID檢測器，流動相為乙腈-水（75∶25，V/V），流速1.0 mL/min，檢測器溫度30 ℃，柱溫箱溫度30 ℃。3 種糖分別用超純水配制為0.06～9.0 mg/mL系列質(zhì)量濃度，并依據(jù)質(zhì)量濃度與峰面積關(guān)系繪制標準曲線定量。

1.3.2 游離氨基酸的測定

采用OPA衍生法進行游離氨基酸的測定[10]。取2.0 g剪碎的冷凍玉米粒，加入氯仿-甲醇（30∶70，V/V）溶液10 mL，在液氮下研磨勻漿，用6 mL蒸餾水提取3 次后合并水層，冰上靜置30 min。取上清液10 μL加入50 μL硼酸緩沖液（0.4 mol/L pH 10.2）以及10 μL OPA試劑進行衍生，混勻后靜置30 s，加入640 μL蒸餾水并混勻，過0.45 μm微孔濾膜，待進樣。

HPLC檢測條件：采用ZORBAX Eclipse-AAA色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）以及DAD；流動相A為0.04 mol/L pH 7.8的NaH2PO4溶液，B為乙腈-甲醇-水（45∶45∶10，V/V）；設(shè)定流速為2 mL/min；洗脫梯度：1.9～18.1 min，100%～43% A、0%～57% B；18.1～18.6 min，43%～0% A、57%～100% B；18.6～22.3 min，0% A、100% B；22.3～23.2 min，0%～100% A、100%～0% B。運行時間26 min；流速2.0 mL/min；樣品間色譜柱平衡5 min；柱溫40 ℃；檢測波長338 nm，參比波長390 nm。

通過與標準樣品保留時間的比對進行定性，多點校正法進行定量。采用0.1 mol/L鹽酸稀釋氨基酸混合標樣為0.125～2.5 μmol/mL系列濃度，OPA衍生后進行HPLC測定，依據(jù)濃度與對應(yīng)峰面積繪制標準曲線，計算時轉(zhuǎn)化為質(zhì)量濃度。谷氨酰胺、天冬酰胺和GABA則直接采用超純水配制為0.01～0.5 mg/mL的溶液進行衍生與標準曲線繪制。

1.4 數(shù)理統(tǒng)計

采用JMP 10.0進行單因素方差分析、主成分分析及聚類分析。P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 2 種鮮食玉米發(fā)育過程中游離糖變化與比較

2 種鮮食玉米中均檢測到蔗糖、果糖和葡萄糖，在發(fā)育早期（＜授粉后10 d），含量最高的糖為葡萄糖，隨后蔗糖含量迅速升高，成為含量最高的糖（圖1A1、B1）。晶甜5號游離糖總量最高值出現(xiàn)在授粉后22 d（圖1A2），此時蔗糖也達到最高值；晶糯8號游離糖總量最高值出現(xiàn)在授粉后13 d（圖1B2），此時期恰處于籽粒發(fā)育的初期，蔗糖比例迅速提高（圖1B1），但尚未成為含量最高的糖。取2 種玉米總糖和蔗糖最高值進行比較，晶甜5號中游離糖總量為晶糯8號的1.33 倍，但蔗糖（83.96 mg/g）是晶糯8號（30.57 mg/g）的2.88 倍，可以看出晶甜5號中蔗糖的比例高于晶糯8號。Reyes等[4]認為甜玉米甜味的感知更多與蔗糖而不是果糖或葡萄糖相關(guān)，這可能與蔗糖在含量上的絕對優(yōu)勢有關(guān)。其測定的“Xtra sweet 77”和“Jubilee”2 個甜玉米品種的蔗糖含量分別為葡萄糖和果糖含量之和的2.66 倍和4.78 倍。晶甜5號授粉后13～28 d蔗糖為葡萄糖和果糖含量之和的1.17～12.21 倍，并且隨發(fā)育期延長此比例呈升高趨勢，也表現(xiàn)為蔗糖為主的特點。由計算可知，與晶甜5號不同，晶糯8號在授粉后13 d蔗糖/（果糖+葡萄糖）比值為0.35，隨后雖然蔗糖含量最高，授粉后16～25 d比值變化范圍僅為1.22～2.59。按照糖類的相對甜度即蔗糖的相對甜度為100，果糖和葡萄糖的相對甜度分別為150與70[17]，可以發(fā)現(xiàn)2 種玉米甜度值與總糖含量變化基本一致，晶甜5號總糖達最高值時（授粉后22 d），甜度值也最高，并均顯著高于總糖和甜度值達最高值時的晶糯8號（授粉后13 d）。

圖1 2 種鮮食玉米發(fā)育過程中游離糖含量和甜度變化Fig. 1 Changes in sweetness and free sugar contents in two table corn cultivars during development

2.2 2 種鮮食玉米發(fā)育過程中游離氨基酸變化與分析

18 種氨基酸得以定量分析，包括Asp、Glu、Asn、Ser、Gln、His、Gly、Thr、Arg、Ala、Tyr、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Lys以及GABA。所有樣品中均未檢測到Cys，而Pro因方法所限未能測定。

如圖2所示，2 個鮮食玉米品種的游離氨基酸總量均在乳熟期達到最高值，晶甜5號為授粉后19 d，略早于游離糖總量達最高值時（授粉后22 d）；晶糯8號則在授粉后16 d達最高值，略晚于游離糖總量達最高值時（授粉后13 d）。

參照蘑菇中氨基酸的呈味特點[8]，將玉米中的氨基酸分為甜味、鮮味、苦味3 類呈味氨基酸，晶甜5號和晶糯8號在發(fā)育過程中各類呈味氨基酸的含量變化分別見圖2A2、B2。甜味氨基酸在2 個品種中均為含量最高的氨基酸，其在授粉后13～22 d晶甜5號中含量均高于氨基酸總量的50%，而在晶糯8號中，只有在授粉后16 d甜味氨基酸含量高于總量的50%，達到51.30%。鮮味氨基酸在甜玉米中呈波浪狀變化，但在晶糯8號中其含量隨發(fā)育時間延長符合線性上升趨勢（r =0.846 08，P＜0.05）。2 種玉米中苦味氨基酸均為含量最低的呈味氨基酸，其最高值的出現(xiàn)時間與甜味氨基酸一致。

圖2 2 種鮮食玉米發(fā)育過程中游離氨基酸總量及分組氨基酸變化Fig. 2 Changes in contents of different taste-active amino acid in two table corn cultivars during development

由圖3可知，對于單個的呈味氨基酸，Ala作為甜味氨基酸，在2 種鮮食玉米發(fā)育過程中含量高且變幅大。從含量分析，Ala在授粉后10～28 d的晶甜5號中為含量最高的氨基酸，占氨基酸總量的28.98%～44.39%；在晶糯8號中，除授粉后22 d和授粉后25 d外，Ala也是含量最高的氨基酸，可達氨基酸總量的22.50%～40.28%。從變幅分析，晶甜5號中Ala含量的最高值為最低值的22.94 倍；在晶糯8號中變幅較小，最高與最低含量的比值為2.68。Ala作為甜味氨基酸，其閾值為60 mg/100 mL[18]，晶甜5號中的最高值可達326.78 mg/100 g，在晶糯8號中最高值為266.05 mg/100 g，均高于閾值，但味覺閾值測定一般為溶液體系測定，由于糖是玉米中主要的甜味物質(zhì)，Ala是否對鮮食玉米甜味有作用仍待確定。游離Glu作為鮮味氨基酸已得到廣泛研究，在成熟的番茄中可高于200 mg/100 g并提供鮮味特征[19]。在晶甜5號和晶糯8號游離糖含量最高的發(fā)育階段，即授粉后22 d（圖1A1）和授粉后13 d（圖1B1），此時Glu含量分別為62.51 mg/100 g和51.40 mg/100 g，均高于Glu溶液的鮮味閾值30 mg/100 mL[18]，并與Masuda等[9]對甜玉米中游離Glu的測定結(jié)果接近。另外Glu在成熟玉米蛋白中常為含量最高的氨基酸，可達總蛋白的20%左右[20]，但在鮮食玉米的發(fā)育過程中，晶甜5號和晶糯8號中的游離Glu為總氨基酸的2.57%～21.99%和5.31%～24.49%，只有在授粉后22～25 d的晶糯8號中表現(xiàn)為含量最高的氨基酸。Asp為對鮮味有貢獻的另一種氨基酸，其滋味閾值為100 mg/100 mL[18]，在晶甜5號和晶糯8號中，Asp含量分別為12.98～55.57 mg/100 g以及12.53～82.74 mg/100 g，處于較低水平。測定發(fā)育期內(nèi)2 個品種中4 種苦味氨基酸含量均低于20 mg/100 g，均在氨基酸總量達最高值時達到最高值（圖3A3、B3）。

晶甜5號與晶糯8號在測定的發(fā)育期中必需氨基酸的總量分別占總氨基酸的20.17%～25.31%與19.21%～25.02%（圖2），較為接近。Val和Thr在8 種必需氨基酸（His、Thr、Val、Phe、Met、Ile、Leu、Lys）中含量最豐，與對鮮食玉米游離氨基酸組成的報道一致[20]。Lys為玉米的限制性氨基酸[20]，測定的2 個品種均為非Lys強化品種，含量很低。近年來對氨基酸功能性的研究顯示補充外源Gln可以有效緩解人的運動疲勞[13]，而GABA則具有神經(jīng)保護作用[14]。晶甜5號和晶糯8號中Gln及GABA含量均較低，最高值尚不及卷心菜[21]的1/3和櫻桃番茄的1/10[7]。游離Asn近年來受到了廣泛的關(guān)注，主要因為它是致癌物丙烯酰胺的前體物[22]，尤其是在馬鈴薯中[23]含量較高，可達94 mg/100 g，占氨基酸總量的1/3，在測定的鮮食玉米中游離Asn含量較低，分布范圍為1.13～20.46 mg/100 g，僅為氨基酸總量的0.28%～3.80%。

圖3 2 種鮮食玉米發(fā)育過程中單一氨基酸含量變化Fig. 3 Changes in contents of individual free amino acids in two table corn cultivars during development

2.3 游離糖與氨基酸變化的多元統(tǒng)計分析

圖4 2 種鮮食玉米發(fā)育過程中游離糖與氨基酸變化的主成分得分圖Fig. 4 PCA scores plots of free sugars and amino acids in two table corn cultivars during development

將2 個品種鮮食玉米所有采收期的游離糖和氨基酸含量數(shù)據(jù)進行主成分分析，前3 個主成分分別提取了總變異的39.9%、24.4%和13.3%。如圖4所示，在PC1上，W-16和S-19的得分最高，其次為S-13與S-16，說明這4 個樣品總游離氨基酸含量偏高，與2.2節(jié)結(jié)論一致；其他樣品中發(fā)育早期的樣品（≤授粉后13 d）和乳熟期樣品在PC2上的得分則按正負分別聚集。另外，在PC3上得分為正值的7 個樣品中有6 個為糯玉米樣品（授粉后10～25 d），而甜玉米樣品則除S-13外，得分全部為負值，說明PC3更多體現(xiàn)了2 種玉米之間的差別。從表1可知，在PC1上載荷大于0.7的指標有Thr，其次有Leu、Ser、Gly、Ala、Val、Ile、Met和His，包括了4 種甜味氨基酸和3/4的苦味氨基酸；在PC2上載荷絕對值高于0.7的指標有Gln、葡萄糖、果糖、蔗糖；在PC3上載荷值排名前二的2 個指標分別為Asp和Glu這2 種鮮味氨基酸，并且均為正值。綜合樣品主成分得分與各指標在主成分上的載荷分析，發(fā)育程度不同是樣品間的主要差異，并主要體現(xiàn)為甜味氨基酸和糖含量變化；其次才是玉米品種間的差異，并主要體現(xiàn)在鮮味氨基酸上。

表1 游離糖與氨基酸的主成分載荷Table 1 PCA loadings of free sugars and amino acids

樣品的聚類分析結(jié)果見圖5。在距離6.06處所有樣品聚為3 類：I為S-1、S-7、W-7、S-10、W-10、S-4、W-13、W-4、S-13、S-16；II為S-22、S-25、S-28、W-19、W-22、W-25；III為W-16與S-19。從樣品采收時的授粉后時間可以看出，第I類為發(fā)育早期的樣品，即早于授粉后13 d的糯玉米和早于授粉后16 d的甜玉米，第II類則與推薦的鮮食適采期基本吻合，為授粉后22～28 d的甜玉米和授粉后16～25 d的糯玉米，第III類則是2 個品種發(fā)育過程中游離氨基 酸含量均達最高之時。這個分類結(jié)果與樣品在PC1和PC2得分圖（圖4）上的分布一致。

圖5 不同發(fā)育階段2 種鮮食玉米聚類分析的樹狀圖Fig. 5 Cluster analysis of two table corn cultivars at different developmental stages

3 討 論

目前，鮮食玉米的適宜采收期多以水分或可溶性糖含量確定[3-5]。陳驍熠等[5]根據(jù)水分含量確定Hz5008超甜玉米的適采期為授粉后18 d，Hz6012普甜玉米為授粉后16 d，但同時發(fā)現(xiàn)2 種玉米總糖出現(xiàn)最高值的時期則分別為授粉后19 d和授粉后18 d，與依據(jù)水分含量推薦的適采期略有偏差。Azanza等[6]發(fā)現(xiàn)授粉后18 d采收時超甜玉米的籽粒飽滿度不夠，但授粉后18～22 d期間，糖含量呈現(xiàn)下降趨勢，因此為得到適宜鮮食的籽粒飽滿度，無法選擇糖含量最高的采收期。劉萍等[3]認為授粉后23～25 d是鮮食糯玉米的最佳鮮食期，而在授粉后17～29 d期間，所有品種的含水量均呈下降趨勢。綜上所述，若以鮮食為目的，無論甜玉米還是糯玉米，選擇的適宜成熟度都可能與水分及糖含量最高時期有一定偏差。本研究發(fā)現(xiàn)，晶甜5號超甜玉米中總糖與總氨基酸最高值分別出現(xiàn)在授粉后22 d與授粉后19 d，與報道中鮮食適采期[3-5]一致，但晶糯8號二者最高值分別出現(xiàn)在授粉后13 d與授粉后16 d，較劉萍等[3]報道的鮮食適采期偏早?？紤]若以制汁為目的，水溶性風(fēng)味成分含量為最重要的指標，與鮮食適采期可能并不完全一致。

可溶性糖作為鮮食玉米最重要的風(fēng)味成分，在不同胚乳類型的玉米在發(fā)育過程中碳水化合物具有不同的變化規(guī)律[24]。晶甜5號為超甜玉米品種[25]，超甜突變體中喪失了腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性，淀粉的合成能力低[26]，導(dǎo)致可溶性糖尤其是蔗糖的大量積累，并且較高蔗糖含量的維持時間長，適宜的果穗采收時間也相對較長。晶糯8號中3 種游離糖的組成比例與晶甜5號不同，蔗糖比例偏低，蔗糖/（葡萄糖+果糖）最高值僅為2.59，而晶甜5號此值可達12.21。除此外，晶糯8號游離糖其最高值出現(xiàn)在灌漿初期（授粉后13 d），然后顯著下降，這可能與此發(fā)育階段糯玉米中游離糖向淀粉的快速轉(zhuǎn)化有關(guān)[24]。

另據(jù)研究，玉米游離氨基酸含量及其組分依賴于不同的遺傳背景，并由少數(shù)基因所控制[27]，其遺傳多樣性已在中國糯玉米育種領(lǐng)域得到了重視[28]。晶甜5號甜玉米授粉后19～25 d時鮮味和甜味2 類氨基酸分別占總氨基酸的17.34%～19.50%和58.26%～60.44%，與Masuda等[9]相比，鮮味氨基酸占比偏高，而甜味氨基酸占比偏低。參照孟強等[28]測定的糯玉米自交系中呈味氨基酸在總氨基酸的比例范圍（鮮味氨基酸5.97%～47.36%；甜味氨基酸4.85%～30.72%），晶糯8號在授粉后16～25 d鮮味和甜味2 類氨基酸分別占總氨基酸的29.19%～49.66%和32.61%～46.80%，屬于呈味氨基酸比例偏高的品種。本研究還發(fā)現(xiàn)Glu和Asp含量變化也是2 個品種的重要差異，Asp是連接氨基酸代謝和糖代謝的紐帶[29]，Glu則與玉米的氮素利用即蛋白的合成密切相關(guān)[30]。2 個鮮食玉米品種間的差異主要體現(xiàn)在Asp與Glu 2 種氨基酸上，說明除碳水化合物代謝是甜玉米和糯玉米的主要區(qū)別外，氮素的利用與代謝也有所不同。鮮食玉米不同品種和類型在呈味氨基酸組成上存在一定差異，而具體如何影響鮮食玉米加工產(chǎn)品風(fēng)味仍待深入研究。從營養(yǎng)角度分析游離氨基酸，則可發(fā)現(xiàn)測定的2 個品種中限制性必需氨基酸Lys[20]以及近年來廣受關(guān)注的功能氨基酸Gln[13]、GABA[14]和可作為有害成分丙烯酰胺前體物的Asn[11]含量均偏低，不足以引起重視。另外，這幾種氨基酸在前3 個主成分上載荷最高的只有Asn與Gln，而這2 種氨基酸在高等植物氨同化途徑中與鮮味氨基酸Asp和Glu可相互轉(zhuǎn)化[30]。綜上推測，鮮食玉米中氨基酸的呈味作用更值得關(guān)注。

4 結(jié) 論

晶甜5號超甜玉米和晶糯8號糯玉米中在發(fā)育過程中游離糖和游離氨基酸含量變化存在一定差異：1）晶甜5號游離糖含量和游離氨基酸的最高值分別出現(xiàn)在授粉后22 d與授粉后19 d，晶糯8號達最高值時發(fā)育時間較短，分別出現(xiàn)于授粉后13 d與授粉后16 d；2）晶糯8號中鮮味氨基酸在發(fā)育過程中呈線性上升趨勢，并成為區(qū)別于晶甜5號的重要特征。綜上所述，游離糖和游離氨基酸在鮮食玉米制汁適宜采收期的確定以及對不同鮮食玉米風(fēng)味的差異分析上均具有重要的參考價值，對于鮮食玉米加工尤其是玉米汁生產(chǎn)中風(fēng)味調(diào)控有實際意義。