辣木籽油功能性成分檢測及多元統計分析

王鐵旦，楊 敏，楊 芳，杜 萍,*

（1.昆明理工大學分析測試研究中心，云南省分析測試中心，云南 昆明 652094；2.十堰市疾病預防控制中心，湖北 十堰 442000；3.武漢工程大學環境生態與生物工程學院，湖北 武漢 430205）

辣木是一種具有獨特經濟價值的熱帶植物，為辣木科（Moringaceae）辣木屬（MoringaAdans.）多年生熱帶落葉喬木[1]，又被稱為楊椿樹、鼓槌樹或辣根樹[2]。目前，種植最多的辣木品種是印度辣木（M. oleifera）和非洲辣木（M. stenopetala），其中又以印度辣木分布最廣[3]。辣木素來就有“奇跡之樹”的美譽[4-5]，其葉、種子、樹皮以及根等均是民間傳統的藥物，用于保健和治療多種疾病。研究表明，辣木具有抗腫瘤[6]、降血糖[7]、免疫調節[8]、抑菌[9]、抗病毒[10]、抗輻射[11]等多種藥理作用，被譽為新時代的健康食物。2012年，辣木已被批準為新資源食品，很多地區開始重視辣木的引種培育和開發利用，包括我國的云南、臺灣、廣東及廣西[12]。

作為辣木加工副產物，辣木籽中油脂含量為25%～35%[13]，目前，辣木籽油的提取工藝有壓榨法[14]、微波輔助提取[15]、水酶法[16]、亞臨界萃取[17]以及同時蒸餾萃取法[18]等。化學組成方面研究主要包括脂肪酸組成，作為構成油脂主要成分，脂肪酸的組成及配比很大程度上決定了植物油脂的營養價值和生物活性，是評價植物油的主要指標之一[19]。辣木籽中不飽和脂肪酸含量較高，其中油酸含量大于50%[20]。辣木籽油中還含有多種功能性成分，例如，生育酚和植物甾醇等可作為優質的食用油來源[13]。植物甾醇是一類以環戊烷全氫菲為主體骨架的活性物質，其中含量較多的有β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇以及谷甾烷醇等，具有降血脂、降膽固醇、預防心血管疾病等作用，可用作食品抗氧化劑[21]。

我國云南省在20世紀初已從緬甸引種辣木[22]，并進行辣木籽油系列產品的開發與精深加工[23]，目前國內外對辣木的研究主要集中在辣木葉，而對辣木籽油中功能性成分的報道較少。為提高辣木綜合加工的附加值，本實驗從云南省8 個有代表性的產區的辣木籽中提取油脂，采用氣相色譜-質譜聯用技術研究其脂肪酸組成，采用高效液相色譜法測定其生育酚和甾醇的含量，并用主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析（clustering analysis，CA）等多元統計方法對云南八產區的辣木籽油功能性成分進行差異分析，構建云南八產區辣木籽油功能性成分的綜合指標評價模型，以期為辣木籽綜合開發中原料的優選分級和功能因子評價提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木籽樣品采自云南省8 個辣木產區，編號為S1～S8，詳細信息見表1，其品種均為印度辣木。樣品經過挑選、烘干及粉碎后過40 目篩即得辣木籽粉，干燥密封待用。

生育酚系列標準品DL-α-生育酚（＞96%）、(+)-δ-生育酚（＞98%）、豆甾醇（純度90%） 美國Sigma公司；其他試劑均為國產。

表1 辣木籽樣品產地Table 1 Qeographical origins of M. oleiffeerraa seed samples used in this study

1.2 儀器與設備

S C I O N S Q 4 5 6-G C氣相色譜-質譜聯用儀美國B u r k e r公司；D B-W A X彈性石英毛細管柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）、75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭 美國Supelco公司；KQ2200型超聲波提取儀昆山市超聲儀器有限公司；R-201D-II型旋轉蒸發儀鄭州長城科工貿有限公司；ACQuity Arc高效液相色譜儀、Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）美國沃特世公司。

1.3 方法

1.3.1 辣木籽油的提取

參考王 美霞等[24]的方法提取油脂，略有改動。分別稱取辣木籽粉樣品17.0 g于三角燒瓶中，加入100 mL沸程30～60 ℃的石油醚，浸泡過夜，離心，濾渣用30 mL的石油醚分3 次洗滌，合并濾液及洗滌液于圓底燒瓶，經旋轉蒸發濃縮、干燥制得辣木籽油。將含有辣木籽油的浸提燒杯于80 ℃烘干至恒質量，冷卻稱質量，并按下式計算含油量：

式中：A0為辣木仁樣品質量/mg；A1為浸提燒杯質量/mg；A2含有辣木籽油的浸提燒杯質量/mg。

1.3.2 辣木籽油脂肪酸組成分析

甲酯化條件：稱取油樣0.2 g于20 mL具塞試管中，加入4 mL 0.4 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，搖勻。于60 ℃水浴中加熱至油珠完全溶解（約30 min），冷卻后加入2.0 mL的25%三氟化硼-甲醇溶液，于60 ℃水浴酯化20 min，冷卻至室溫后加入2.0 mL正己烷，搖勻；再加入2 mL飽和氯化鈉溶液搖勻，10 000 r/min離心5 min，取上層溶液進行GC-MS分析。

氣相色譜條件：DB-WAX彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：170 ℃，保持1 min，以4 ℃/min升溫至260 ℃，保持10 min。進樣方式為分流進樣，分流比10∶1，進樣量0.2 μL；進樣口溫度260 ℃，檢測器溫度280 ℃，載氣為高純氦氣，流速1.7 mL/min。

質譜條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃。監測方式為全掃描；質量掃描范圍m/z25～450；溶劑延遲時間4 min。

定性方法：將樣品色譜圖中的每個峰與Wiley和NIST譜庫中進行比對，僅選取相似度指數大于800的物質，同時通過比對文獻化合物中的相對保留指數對所得化合物定性結果進行驗證。

1.3.3 辣木籽油生育酚含量測定

皂化前處理[25]：準確稱取1.0 g油樣于10 mL皂化管中，依次加入0.1 g VC、3 mL氫氧化鉀-95%乙醇（2 mol/L）溶液，渦旋30 s后，在90 ℃恒溫振蕩器（220 r/min）中振蕩反應60 min，皂化后冷卻，加入5 mL正己烷，渦旋5 min后，5 000 r/min離心10 min，取上清液，重復2 次。將上清液旋蒸干燥至1 nL左右，用甲醇定容至10 mL。過0.45 μm濾膜，進行高效液相色譜分析。

標準品的配制：分別稱取10 mg的α-生育酚和δ-生育酚標準品，溶于100 mL乙醇中，過0.45 μm濾膜，進行高效液相色譜分析。

高效液相色譜條件：Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇，流速1. 0 mL/min，等度洗脫，柱溫30 ℃。α-生育酚和δ-生育酚的檢測 波長均為292 nm[25]。

1.3.4 辣木籽油甾醇含量測定

取1.3.3節中皂化后的樣品，過0.45 μm微孔濾膜后，進行高效液相色譜測定[25]。

標準品的配制：分別稱取10 mg豆甾醇的標準品，溶于100 mL乙醇中，過0.45 μm濾膜，進行高效液相色譜分析。

高效液相色譜條件：SymmetryC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇，流速為1.0 mL/min，等度洗脫，柱溫30 ℃。豆甾醇的檢測波長為205 nm，進樣量10 μL。

1.4 數據處理

所有數據均為3 組平行實驗數據取平均值；采用IBM SPSS Statistics 25（IBM, Armonk, NY, USA）軟件進行PCA、CA以及顯著性分析，采用Tukey's HSD法進行多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 辣木籽含油量分析

如表2所示，云南八產地辣木籽樣品的含油量在19.50%～26.34%之間，平均含油量為23.10%。含油量最高的是臨滄市耿馬縣辣木樣品S6（23.95%），含油量低的是麗江市華坪縣辣木樣品S5（21.95%），但總體上看，八產地的辣木籽樣品的含油量無顯著差異（P＞0.05）。

表2 不同產地辣木籽的含油量Table 2 Oil yields of M. oleifera seeds from different areas

2.2 辣木籽油脂肪酸組成的氣相色譜-質譜檢測結果

圖1 辣木籽油（S8）脂肪酸樣品的典型總離子流圖Fig. 1 Typical total ion current chromatograms of fatty acids of M. oleifera seed oil (S8) from Shuangbai county, Yunnan

表3 云南八產地辣木籽油脂肪酸組成的氣相色譜-質譜分析Table 3 GC-MS analysis results of fatty acid components of M. oleifera seed oils from eight areas of Yunnan

由圖1、表3可知，從云南八產地辣木籽油中均檢測出20 種脂肪酸，其組成基本一致，其脂肪酸含量前十位分別為9-十八碳烯酸（油酸）、二十二烷酸（山崳酸）、十六烷酸（棕櫚酸）、十八烷酸（硬脂酸）、二十烷酸（花生酸）、(E)-11-二十烯酸、7-十六碳烯酸、二十四烷酸（木焦油酸）、13-二十二碳烯酸（芥酸）以及十七烷酸，可以認為這10 種成分是辣木籽油脂肪酸的主要特征成分。本研究中選用的云南八產地辣木籽油樣品中，不飽和脂肪酸含量平均占65.39%，其中，油酸含量最高（50.16%～56.51%），略低于云南省紅河州的辣木籽油樣品（71.90%）[19]。

2.3 辣木籽油生育酚和甾醇含量測定結果

表4 云南八產地辣木籽油VE和甾醇含量Table 4 Contents of tocopherol and sterol of M. oleifera seed oil samples from eight areas of Yunnan

作為一種公認的天然抗氧化劑，生育酚具有抑制膽固醇合成及腫瘤細胞生長、改善動脈粥樣硬化及預防心血管疾病等生理功效。在化學結構上均系苯二氫吡喃的衍生物，根據甲基位置及數量的不同分為α、β、γ和δ幾種。本實驗中選取α-生育酚和δ-生育酚為代表，研究辣木籽油生育酚的組成，其中α-生育酚的生理活性最強，植物油中生育酚的存在對油脂的氧化穩定性亦具有重要意義。由表4可以看出，辣木籽油中α-生育酚含量為45～80 mg/100 g，平均含量為62 mg/100 g，高于呂秋冰等[26]報道的超聲波輔助提取所得辣木籽油的α-生育酚（0.945 mg/100 g）。辣木籽油中δ-生育酚含量為0.21～0.53 mg/100 g，平均含量為0.40 mg/100 g。

甾醇在降低血清膽固醇、抗菌及消炎等方面具有顯著療效，本實驗中以豆甾醇為代表，研究辣木籽油樣品中的甾醇含量。實驗結果顯示，辣木籽油中豆甾醇含量為243～495 mg/100 g，平均含量為369 mg/100 g。豆甾醇含量最高的辣木籽油產地為S3（西雙版納州景洪市），含量為495 mg/100 g，高于葡萄籽中的豆甾醇含量（15 mg/100 g）[27]。

2.4 不同產地辣木籽油的多元統計分析

2.4.1 不同產地辣木籽油的PCA

采用IBM SPSS Statistics 25軟件對云南八產區辣木籽油樣品含量前十的脂肪酸含量、α-生育酚、δ-生育酚以及豆甾醇進行PCA，結果顯示前4 個主成分的累計方差貢獻率為93.234%（表5），說明前4 個主成分基本包含了辣木籽油脂肪酸組成的絕大部分信息，可用于綜合品質評價與分類。在前4 個主成分中，PC1的貢獻率為28.550%，貢獻最大的為十八烷酸（硬脂酸），對應的特征值為0.371。PC2的貢獻率為28.452%，貢獻最大的為9-十八碳烯酸（油酸）和豆甾醇，對應的特征值為0.392和0.198。PC3的貢獻率為19.214%，貢獻最大的為(E)-11-二十烯酸（花生油酸），對應的特征值為－0.468。PC4的貢獻率為17.018%，貢獻最大的為十七烷酸，對應的特征值為0.415。

表5 PCA特征向量、特征值、方差貢獻率及累計方差貢獻率Table 5 Eigenvectors, eigenvalues, contribution rates and cumulative contribution rates to total variance of principal components

圖2 云南八產地辣木籽油樣品的PCA評分圖Fig. 2 PCA Score plot of M. oleifera seed oil samples from eight areas of Yunnan

PCA可以有效區分不同產地辣木籽油樣品的脂肪酸組成、生育酚及豆甾醇的含量，如圖2所示，在PC1方向上，8 個樣品明顯分為3 個部分，分別為S3、S8以及余下的6 個樣品，3 組樣品在PC2方向也表現出了極大的成分差異性。以4 個主成分F1、F2、F3和F4與其方差貢獻率構建辣木籽油品質指標綜合得分模型F總，F總為因變量，F1、F2、F3和F4為自變量，F總為F1、F2、F3和F4的線性組合：

F總=28.550%F1+28.452%F2+19.214%F3+17.018%F4

各產地辣木籽油在各個主成分的得分值見表6，分值越高代表品質越好。結果顯示，各產地辣木籽油品質評價模型得分具有一定差異性，表明不同產地辣木籽油在脂肪酸組成、生育酚及豆甾醇的含量上存在產地差異性，根據得分和排序，西雙版納州景洪市的S3樣品綜合得分為1.232，高于其他樣品的得分。該樣品具有最高的油酸相對含量（56.51%）、不飽和脂肪酸總相對含量（70.11%）、α-生育酚含量（80 mg/100 g）、δ-生育酚含量（0.53 mg/100 g）以及豆甾醇含量（495 mg/100 g），具有最優的綜合品質。

表6 云南八產地辣木籽油樣品質量評價Table 6 Quality evaluation of M. oleifera seed oil samples from eight areas of Yunnan

2.4.2 不同產地辣木籽油的CA

圖3 云南八產地辣木籽油樣品的CA樹狀圖Fig. 3 Cluster analysis dendrogram of M. oleifera seed oil samples from eight areas of Yunnan

采用IBM SPSS Statistics 25軟件對辣木籽油脂肪酸數據進行系統CA，以平方歐式距離為度量標準，通過組間連接的方式，對云南八產地辣木籽油的脂肪酸組成進行CA。由圖3可知，當距離刻度為1～25時，云南八產地辣木籽樣品可分為3 個集群，第1個集群是S3單獨為1 個集群，該樣品綜合得分為1.232，綜合PCA得分排名第1；其余7 個樣品（S1、S5、S4、S6、S8、S2以及S7）為第2個集群，綜合得分在－0.624～0.215之間，綜合品質低于S3。由此可見，CA可以根據刻度不同獲得多種分類結果，其在刻度為1～25時的分類結果同PCA分析一致，說明2 種分析方法均可對八產地辣木籽樣品進行分類，并通過分類進行綜合品質評價，為今后辣木籽油的生產加工中的品種篩選提供理論依據。

3 討論與結論

作為辣木加工副產物，辣木籽富含多種功能性成分，在食品、藥用及輕工等方面具有很大的應用價值。本實驗以云南八產地辣木籽油為原料，分析辣木籽油中脂肪酸、α-生育酚、δ-生育酚及豆甾醇這幾類脂溶性活性成分的含量，實驗結果顯示，云南八產地辣木籽油均含有20 種脂肪酸，不飽和脂肪酸相對含量平均為65.39%，其中9-十八碳烯酸（油酸）的相對含量均大于50%。辣木籽油中α-生育酚（45～80 mg/100 g）、δ-生育酚（0.21～0.53 mg/100 g）、豆甾醇（243～495 mg/100 g）具有開發功能性大健康產品的潛力。生育酚和豆甾醇的含量差異顯著，可能與不同產地的地理環境、氣候條件等因素有關。通過PCA，根據特征向量構建主成分與各產地辣木籽油品質指標之間的線性函數，構建了辣木籽油綜合品質評價模型，得到不同樣品綜合品質得分從高到低為S3、S1、S5、S4、S6、S8、S2、S7。其中，西雙版納州景 洪市S3樣品的品質明顯高于其他產地樣品，表明綜合指標評價系統能用于辣木籽油品質評價。通過CA，云南八產地辣木籽油可分成2 個集群，綜合評分最高的S3為一個集群，其余7 個樣品為第2個集群，結果與PCA一致。因此，PCA和CA能較好反映辣木籽油樣品間的差異性，本研究可為辣木籽精深加工提供一定的參考依據。