基于KEGG的碳固定和氮代謝通路土壤微生物組篩選

王小利 王淑蘭

(西北農林科技大學農學院, 陜西楊凌 712100)

0 引言

施肥、耕作和秸稈還田是影響土壤微生物數量、群落結構及其功能的主要農業措施，也是實現農田可持續生產的有效措施[1-3]。渭北旱塬地處我國北方半濕潤易旱和偏旱氣候區，耕地面積75%以上為旱作糧田，長期實行“小麥-夏閑”耕作制。根據陜西省農業廳對旱作冬小麥和春玉米平衡施肥推薦方案與渭北旱作高產冬小麥和春玉米常規施肥調查結果，從2007年開始本課題組在渭北旱塬開展了秸稈還田條件下小麥連作糧田的長期定位施肥試驗，設立了常規施肥(SC)、平衡施肥(SB)和低量施肥(SL)3種施肥方式，改進和完善了旱作糧田作物栽培和土壤耕作機制，在蓄水保墑、水土保持、抗旱增產、有機碳積累、微生物多樣性等方面進行了一系列研究[4-7]。但針對長期秸稈還田條件下旱地小麥連作糧田在不同施肥水平下土壤微生物功能的響應機制研究還處于起步階段。碳固定、氮代謝是農田生態系統中微生物最活躍的2個能量代謝途徑，研究表明，化肥會影響秸稈的分解及土壤碳和氮的轉化過程[8-10]。因此，利用長期定位試驗注釋小麥連作糧田土壤碳、氮代謝微生物的功能基因對長期施肥的響應，對探究碳固定、氮代謝通路的分子機制和旱地糧田固碳減排機理具有重要意義。

微生物宏基因組學是由大規模海量測序轉向功能導向的微生物組學研究，基于大規模宏基因組鳥槍法測序和宏基因組序列拼接，并通過與已知基因序列數據庫相似性的比對進行微生物分類和功能的注釋[11-12]。在KEGG數據庫，將行使相同功能的基因聚在一起，稱為KEGG ortholog groups (KO)，每個KO包含多個基因信息，并在一至多個代謝通路中發揮作用，能夠大幅減小測序數據量以及數據分析的工作量，且可用來直接鑒定農田生態系統的特定代謝途徑微生物群落的基因數量[13-15]。本文利用宏基因組測序技術，以KEGG數據庫碳固定、氮代謝2個能量代謝途徑(map00720、map00910)為研究工具，以陜西渭北旱塬小麥連作糧田深松和秸稈還田的長期定位試驗為基礎，以常規施肥(SC)、平衡施肥(SB)和低量施肥(SL)3種施肥土壤為研究對象，對影響其農田生態系統中碳固定、氮代謝相關的物種及功能基因進行篩選，分析微生物物種與功能的關系及其對長期施肥的響應，為探討該地區小麥糧田土壤微生物的碳固定、氮代謝機理及區域糧田可持續發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

陜西省合陽縣甘井鎮西北農林科技大學旱農試驗站(35°19′54.45″N, 110°5′58.35″E)位于渭北旱塬東部,海拔877 m,屬典型的黃土高原溝壑區,暖溫帶半干旱型大陸性季風氣候,多年平均降雨量為536.6 mm, 主要集中在7—9月。土壤為黑壚土。

長期定位施肥和耕作試驗于2007年9月—2016年6月實施，品種為長旱58。試驗小區有3個，每個小區面積110 m2(22 m×5 m)。前茬小麥收獲時秸稈高留茬20～30 cm覆蓋地表，每間隔40～60 cm寬度留茬深松35～40 cm，夏閑期噴灑除草劑防除雜草。在休閑期滿后作物播種時，采用3種施肥方式：①平衡施肥(SB)：N施肥量150 kg/hm2，P2O5施肥量120 kg/hm2，K2O施肥量90 kg/hm2。②常規施肥(SC)：N施肥量255 kg/hm2，P2O5施肥量90 kg/hm2。③低量施肥(SL)：N施肥量75 kg/hm2，P2O5施肥量60 kg/hm2，K2O施肥量45 kg/hm2。氮、磷、鉀肥分別以尿素、磷酸二銨和硫酸鉀的形式定位施入。田間管理按照本地高產田措施進行良好管理。在2016年6月小麥收獲后采集10～20 cm表層土壤樣品，每個小區3個重復，每個重復選3個點采樣混合過篩，于田間放入液氮罐中，到室內保存于-80℃超低溫冰箱中，用于土壤微生物宏基因組測序。2007—2016年各處理平均小麥產量：低量施肥為3 405.7 kg/hm2，常規施肥為3 953.2 kg/hm2，平衡施肥4 194.7 kg/hm2。2016年6月小麥收獲后10～20 cm土層養分情況如表1所示。

表1 10～20 cm土層養分情況Tab.1 Nutrient status of 10～20 cm soil layer

1.2 DNA提取、文庫構建及測序

采用 CTAB 法對樣本的基因組DNA進行提取，瓊脂糖凝膠電泳分析DNA的純度和完整性；檢測合格的DNA樣品用超聲波破碎儀隨機打斷成長度約為350 bp的片段，經末端修復、加A尾、加測序接頭、純化、PCR(聚合酶鏈式反應)擴增等步驟完成整個文庫制備。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度混合后進行Illumina HiSeq測序[16-19]。

1.3 信息分析

1.3.1數據質控

首先對原始數據進行質控及宿主過濾，然后進行宏基因組(metagenome)組裝，并采用MetaGeneMark軟件進行基因預測，構建基因目錄，獲得各樣品中的豐度信息[16-17]。

1.3.2物種及功能基因注釋

從基因目錄出發，與MicroNR庫進行比對，獲得每個基因的物種注釋信息，并結合基因豐度，獲得不同分類層級的物種豐度；從基因目錄出發，進行碳固定、氮代謝通路(map00720、map00910)的功能注釋和豐度分析[18-19]。

1.3.3代謝通路分析

基于功能豐度，進行豐度聚類分析，對代謝通路進行比較分析，分析處理之間的功能組成差異及其與物種的相關性[20-23]。

2 結果與分析

2.1 土壤微生物功能基因比較分析

質控后總測序數據量為124 651.25 Mbp，組裝得到4 250 132 693 bp的Scaffolds，預測得到7 682 452條ORFs，經去冗余后得到4 588 922條ORFs。其中有1 344 013 (29.29%)個基因能夠比對上KEGG數據庫，有706 049(15.39%)個基因能夠比對上數據庫中的5 734個KEGG KO。對3個施肥水平土壤微生物KEGG數據庫第3水平的所有代謝通路的功能基因進行PcoA分析(主坐標分析)，基于功能基因豐度表得到Bray-Curtis距離矩陣，樣品距離越接近，表示功能基因組成越相似，功能基因結構相似度高的樣品傾向于聚集在一起，功能基因差異大的樣品則會遠遠分開。從圖1可以看出施肥對KEGG數據庫檢測到的代謝通路有明顯的影響，表現為SC與SB的土壤功能基因組成相似度高，而與SL相似度較低。

圖1 KEGG第3水平的PcoA分析Fig.1 PcoA analysis at Level 3

2.2 碳固定途徑功能基因分析

2.2.1施肥方式對碳固定途徑功能基因的影響

通過與KEGG途徑中的碳固定通路比對，發現檢測到功能基因48個，而且3種施肥方式土壤檢測到的功能基因相同(圖2紅色框內表示3種施肥方式檢測到的基因)。

圖2 3種施肥方式的碳固定途徑檢測到的基因Fig.2 Gene detected by carbon fixation pathway of three fertilization methods

通過3種施肥方式的碳固定途徑的主要功能基因(豐度排名前十)比較(圖3)發現， SC(相對豐度累加值為1.65×10-3)的主要功能基因相對豐度累加大于SB(1.55×10-3)，SB的主要功能基因相對豐度累加大于SL(1.10×10-3)，說明施肥明顯改變了碳固定的主要功能基因豐度。

圖3 碳固定途徑的主要功能基因比較Fig.3 Comparison of major functional genes in carbon fixation pathway

2.2.2碳固定途徑物種與功能基因相關分析

通過基因目錄與MicroNR庫比對，利用屬水平的物種與碳固定途徑的主要基因進行相關分析，選擇相關系數大于0.8和小于-0.8的物種33個屬，發現有24個屬與碳固定的基因有0.05水平顯著相關關系(圖4)。進一步研究發現其中13個物種(Sorangium、Spiribacter、Lentzea、Rhodovibrio、Pseudomonas、Flavihumibacter、Streptomyces、Nitrososphaera、Rubrobacter、Dyadobacter、Novosphingobium、Pedosphaera、Thermogemmatispora)與28個功能基因有0.01水平的極顯著差異。這13個物種是這一地區小麥連作土壤微生物碳固定途徑的標記性微生物種群。在這28個基因中，與5個以上屬有極顯著性差異的基因有14個:E4.2.1.2A.fumA.fumB、E2.3.1.9.atoB、mdh、ACSS.acs、korB.oorB.oforB、pps.ppsA、ppdK、sdhA.frdA、K18594、K18604、E4.2.1.2B.fumC、folD、ppc、accA，為小麥連作糧田土壤微生物碳固定途徑的標記性基因。

圖4 碳固定途徑的物種(屬)與基因相關分析Fig.4 Analysis of species (genus) and gene correlation of carbon fixation pathway

2.3 氮代謝途徑功能基因分析

2.3.1施肥方式對氮代謝途徑功能基因的影響

通過與KEGG途徑中的氮代謝通路比對，發現檢測到基因46個，且檢測到的3種施肥方式基因數目相同(圖5紅色框內表示3種施肥方式檢測到的基因)。

圖5 3種施肥方式的氮代謝通路Fig.5 Nitrogen metabolism pathways of three fertilization methods

通過3種施肥方式的氮代謝途徑的主要功能基因(豐度排名前十)比較發現(圖6)，SB(相對豐度累加值為1.10×10-3)的主要功能基因相對豐度累加大于SC(1.00×10-3)，SC的主要功能基因相對豐度累加明顯大于SL(6.50×10-4)，說明施肥明顯改變了氮代謝的主要功能基因豐度。

圖6 氮代謝途徑主要功能基因比較Fig.6 Comparison of major functional genes in nitrogen metabolism pathway

2.3.2氮代謝途徑物種與功能基因相關分析

通過基因目錄與MicroNR庫比對，利用物種與氮代謝途徑基因進行相關分析，選擇相關系數大于0.8和小于-0.8的13個屬的物種，與氮代謝途徑的主要基因進行相關分析(圖7)，篩選出代表性的物種和基因。具有0.01極顯著相關的物種有7個：Sphingopyxis、Alcanivorax、Nitrosospira、Aeromicrobium、Roseiflexus、Devosia、Altererythrobacter。具有極顯著的基因有12個，其中與4個以上物種顯著相關的功能基因有5個：nirB、 nasA、 nasB、 nrt.nak.nrtP.nasA、 GDH2。

圖7 氮代謝途徑的響應物種與基因相關分析Fig.7 Correlation analysis of species and genes in response to nitrogen metabolism pathway

3 討論

3.1 碳固定和氮代謝途徑功能微生物篩選

本研究發現旱地麥田在深松+秸稈還田的條件下，施用化肥明顯改變了土壤碳固定和氮代謝途徑的物種及功能基因豐度。常規施肥和平衡施肥的主要功能基因豐度均大于低量施肥；在碳固定途徑中常規施肥主要功能基因豐度大于平衡施肥，在氮代謝途徑中平衡施肥主要功能基因豐度均大于常規施肥。這說明常規施肥對碳固定的作用更大一些，平衡施肥則更利于氮代謝。同時通過功能微生物的篩選，沒有篩選到碳固定和氮代謝協同的微生物，說明在秸稈還田和深松的小麥連作農田生態系統中微生物物種是分工協作的，碳固定和氮代謝分別有各自特有的主要物種。因此可以利用篩選到的物種進行土壤微生物多樣性研究的標記物種；也可以通過功能基因作標記來檢測渭北旱塬農田土壤微生物基因豐度及其對環境因子的響應，為進一步研究這一地區的土壤微生物組提供了便利條件。

3.2 施肥對土壤微生物碳固定的影響

本文是在深松+秸稈還田的保護性耕作情況下進行不同施肥水平試驗，土壤微生物固碳途徑物種和功能基因豐度的變化是耕作、施肥和秸稈還田共同作用的結果。秸稈還田為微生物的生長繁殖提供了大量的碳源和能源，小麥根系分泌物也會影響微生物的組成及數量，進而影響土壤碳固定活性；化肥的施用能夠直接改變土壤中有機碳的結構與含量，顯著增加或抑制土壤微生物的增殖。化肥的合理施用能夠改變土壤中有機碳的含量，增加固碳微生物的繁殖；在貧瘠的土壤施用化肥，土壤中有機碳含量受限會促進微生物分泌更多的胞外酶，從而加速土壤有機質的分解，增加土壤碳固定；反之，肥沃的土壤不合理地大量施肥，微生物活性降低、數量減少，同時小麥產生胞外酶也減少，抑制有機碳的分解，反而降低土壤碳固定活性[24-26]。所以氮肥優化管理措施可以通過提高作物產量，增加作物根系分泌物量及秸稈產量，促進土壤碳庫積累。本研究發現在秸稈還田和深松耕作條件下，碳固定途徑中平衡施肥和常規施肥都增加了基因豐度，而且常規施肥的碳固定功能基因響應略大于平衡施肥，說明常規施肥在當地小麥生產中有一定的利用價值，還沒有達到抑制碳固定的程度，在秸稈還田下化肥使用量對碳固定的閾值，還需要進一步研究。

3.3 施肥對土壤微生物氮代謝的影響

土壤環境中氮的濃度和形態發生變化會導致土壤微生物氮代謝通路改變，土壤微生物對氮素營養的吸收利用機制及分子層面的響應表現出不同的生理活動和生長狀況，以更好地適應環境[27]。本研究發現在秸稈還田和深松耕作條件下氮代謝途徑中，以平衡施肥功能基因豐度最大，常規施肥次之，低肥處理最低。而2007—2016年9年平均小麥產量低量施肥處理為3 405.7 kg/km2，常規施肥為3 953.2 kg/km2，平衡施肥4 194.7 kg/km2，即平衡施肥大于常規施肥，常規施肥大于低量施肥，說明小麥產量與土壤微生物氮代謝功能基因有一定的協同性；但化肥使用量與氮固定基因豐度、產量并沒有一致性的響應。所以常規施肥量不僅不利于土壤氮代謝微生物氮代謝通路功能基因豐度的增加，也不能帶來更高的小麥產量，不利于土壤的可持續利用。同時，化肥施用也是影響土壤N2O排放最重要的因素，因為其可以直接為硝化和反硝化微生物提供作用底物[28-29]。所以，在本試驗中，平衡施肥是該地區比較合理的施肥方式，有利于維持小麥產量、土壤氮代謝活力以及溫室氣體排放的平衡，對土壤可持續利用和節肥減排具有一定的指導意義。

4 結束語

常規施肥與平衡施肥處理的麥田土壤微生物功能基因豐度關系密切，而與低量施肥處理關系較遠。施肥明顯改變了碳固定、氮代謝功能基因豐度，常規施肥和平衡施肥的主要功能基因豐度均大于低量施肥；在碳固定途徑中常規施肥主要功能基因豐度大于平衡施肥，在氮代謝途徑中平衡施肥主要功能基因豐度大于常規施肥。篩選得到碳固定途徑微生物13個屬，與之緊密相關的功能基因14個；篩選得到氮代謝途徑微生物7個屬，與之緊密相關的功能基因5個。平衡施肥更有益于節肥減排和土壤的可持續利用，是適合該地區小麥連作糧田的施肥方式。