阿卡波糖生產(chǎn)過程中菌渣高效滅活及減量化技術(shù)研究

徐亞強(qiáng)，肖 楠，許樂義

(杭州中美華東制藥有限公司 浙江杭州 310011)

阿卡波糖是通過游動放線菌的發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)的[1]，在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量的菌體廢渣，主要含有蛋白質(zhì)、殘留培養(yǎng)基、代謝產(chǎn)物、菌絲體、部分殘留阿卡波糖以及提取過程中加入的助濾劑、絮凝劑等；若殘留培養(yǎng)基、殘留藥物以及活菌體進(jìn)入環(huán)境中，日積月累會給環(huán)境帶來潛在的危害[2]。現(xiàn)階段主要通過高溫焚燒對發(fā)酵菌渣進(jìn)行處理，但處理裝置的投資和運(yùn)行費(fèi)用過高，而且極易對環(huán)境造成二次污染[3-4]。

隨著國家仿制藥一致性評價(jià)及帶量采購的逐步落實(shí)，降低阿卡波糖生產(chǎn)成本是企業(yè)發(fā)展的必由之路，因此發(fā)展低廉、環(huán)保的菌渣處理工藝刻不容緩，探討菌渣細(xì)菌滅活、減量化處理顯得尤為重要。

阿卡波糖菌渣中含有較豐富的有機(jī)質(zhì)、粗脂肪、粗蛋白、無機(jī)鹽、氨基酸和微量元素，將菌渣制成有機(jī)肥料或土壤調(diào)理劑等資源化產(chǎn)品，是生物醫(yī)藥菌渣經(jīng)無害化處理后進(jìn)行資源化綜合利用的有效途徑之一[5-6]。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

主要試劑：氫氧化鈉，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、乙酸銨，分析純，江蘇強(qiáng)勝功能化學(xué)股份有限公司；去離子水、阿卡波糖菌渣，杭州中美華東制藥有限公司。

主要儀器：ME204E型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；101A-2B型烘箱，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；Toledo FE20型pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；TDL-40B型離心機(jī)，上海精若科學(xué)儀器有限公司；奧里龍-1811微鈉離子監(jiān)測儀，Thermo Scientific Co., Ltd.；TSQ Quantum Ultra高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；CNW Athena-C18色譜柱，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；KQ-500DE超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司；DDSJ-308A電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SNB-2旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)，上海地學(xué)儀器研究所。

1.2 阿卡波糖菌渣液的配制

試驗(yàn)原料取自阿卡波糖生產(chǎn)車間，為板框壓濾后的菌渣，含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)約60%。將阿卡波糖菌渣與一定量的清水混合并攪拌均勻，配制成不同固含量的菌渣液進(jìn)行細(xì)菌滅活及減量化試驗(yàn)。

1.3 細(xì)菌滅活

阿卡波糖的穩(wěn)定pH為5.5～6.8，極端pH會造成阿卡波糖的降解[7]。試驗(yàn)采用堿解法對菌渣進(jìn)行滅活，考慮到生產(chǎn)成本及加堿造成后期鹽分洗脫的困難，必須控制適宜的加堿量。為此，控制NaOH的加入比例(干基菌渣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)分別為2%、4%、6%、8%，通過測定菌渣漿液的黏度、處理后菌渣中的阿卡波糖殘留效價(jià)及活菌數(shù)等工藝指標(biāo)，探究不同加堿比例對菌渣無害化的影響。

1.4 板框壓濾

板框壓濾是固液分離的常用方法[8-9]。以堿解法處理后的菌渣濾液為試驗(yàn)原料，利用板框壓濾機(jī)對其進(jìn)行減量化研究。試驗(yàn)設(shè)置0.5、1.0、1.5、2.0 MPa 4個不同的操作壓力，探究不同操作壓力對菌渣減量化的影響。

1.5 檢測指標(biāo)

菌渣含水率采用稱重法測定；pH采用pH計(jì)測定；阿卡波糖活菌數(shù)采用平皿培養(yǎng)法測定，即1 g濾渣加無菌水5 mL，于4 000 r/min條件下離心分離5 min，取上清液1 mL涂平皿；鈉離子采用微鈉離子監(jiān)測儀測定；黏度采用旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測定。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定阿卡波糖含量[10-11]：采用TSQ Quantum Ultra高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和CNW Athena-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm)；流動相為乙酸銨溶液-乙腈，梯度洗脫；流速300 μL/min，柱溫25 ℃，紫外檢測波長210 nm，進(jìn)樣量10 μL；質(zhì)譜條件采用正離子掃描，選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式進(jìn)行特征母離子信號的采集，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行定量。

處理后菌渣中阿卡波糖含量的測定方法：取適量壓濾后的菌渣，通過稱重法測定其含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)；以60 ℃的去離子水作為提取劑，超聲提取100 min，重復(fù)提取2次；將2次提取液合并進(jìn)行濃縮，濃縮時加入乙腈有效沉淀蛋白質(zhì)；采用TSQ Quantum Ultra高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定濃縮液中的阿卡波糖含量，則處理后的干菌渣中阿卡波糖的含量按式(1)計(jì)算：

C干菌渣=V×C提取液/[m×(1-W)]

(1)

式中：m——壓濾后的菌渣取樣量，kg；

W——壓濾后的菌渣含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

V——濃縮后的提取液體積，mL；

C提取液——提取液中阿卡波糖的含量，mg/mL。

處理后菌渣中鹽含量采用電導(dǎo)率測試法測定，即：取10 g處理后的濕菌渣，加10 mL去離子水，攪拌均勻后于4 000 r/min的條件下離心分離5 min，取上清液測電導(dǎo)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌渣含固質(zhì)量分?jǐn)?shù)對反應(yīng)體系初始黏度的影響

菌渣含固質(zhì)量分?jǐn)?shù)反映了體系對菌渣的處理量，而黏度是反映體系流動性的重要指標(biāo)。菌渣含固質(zhì)量分?jǐn)?shù)大，反應(yīng)體系初始黏度較高，體系流動性差，不利于體系的均勻反應(yīng)；菌渣含固質(zhì)量分?jǐn)?shù)小，將導(dǎo)致菌渣處理量降低，不僅增大了處理成本，而且引入的大量水分對后續(xù)抽濾、回用、干燥等均產(chǎn)生不利的影響。因此，選擇合適的菌渣含固質(zhì)量分?jǐn)?shù)非常重要。

如表1和圖1所示：反應(yīng)體系初始黏度隨菌渣含固質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大呈指數(shù)增長趨勢；當(dāng)菌渣含固質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到22%～25%時，由于反應(yīng)體系初始黏度太大，旋轉(zhuǎn)黏度儀無法進(jìn)行測定。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，菌渣含固質(zhì)量分?jǐn)?shù)控制在15%～20%范圍內(nèi)較好，最終確定菌渣含固質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%。

表1 菌渣含固質(zhì)量分?jǐn)?shù)對常溫調(diào)漿黏度的影響

2.2 細(xì)菌滅活工藝

在細(xì)菌滅活工藝的研究過程中，考察了不同NaOH加入比例和停留時間對阿卡波糖殘留值和活菌數(shù)的影響。由表2可知：隨著NaOH停留時間的延長，阿卡波糖殘留量及活菌數(shù)降低，最佳停留時間為6 h；在NaOH加入比例為6%時，阿卡波糖殘留值和活菌數(shù)即可達(dá)到很小的數(shù)值，其中阿卡波糖殘留值可降至30 mg/kg以下，繼續(xù)增大NaOH加入比例對目標(biāo)的控制作用并不明顯，反而會增加后期鹽分洗脫的難度，故最佳的NaOH加入比例為6%。NaOH加入比例及停留時間對體系黏度的影響不大，隨著加堿量的增加和停留時間的延長，體系黏度整體呈現(xiàn)較為穩(wěn)定的狀態(tài)，均處于有利于過濾的范圍內(nèi)，不會影響過濾效率。

表2 不同NaOH加入比例和停留時間對阿卡波糖殘留值和活菌數(shù)的影響

2.3 板框壓濾機(jī)操作壓力對菌渣減量化的影響

上述經(jīng)無害化處理后的混合料漿由板框進(jìn)料泵送入板框壓濾機(jī)進(jìn)行固液分離，板框壓濾機(jī)操作壓力設(shè)置0.5、1.0、1.5、2.0 MPa 4個梯度，用飲用水頂洗菌渣以清除其中的鹽分，通過測定壓濾后菌渣的含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)和電導(dǎo)率來考察不同操作壓力和不同頂洗水量對菌渣減量化及含鹽量的影響。由表3可知：隨著板框壓濾機(jī)操作壓力的提高，菌渣的含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸降低；當(dāng)板框壓濾機(jī)的操作壓力達(dá)到1.0 MPa以上時，菌渣含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)的降幅減小?？紤]到能源的綜合利用和能耗成本，板框壓濾機(jī)操作壓力控制在1.0 MPa即可達(dá)到較好的分離效果。由表4可知：水洗可以有效清除菌渣中的鹽分，隨著頂洗水量的增加，電導(dǎo)率逐步降低，即所含的鹽分逐漸減少；當(dāng)頂洗水量為3～4 BV(菌渣體積倍數(shù))時，電導(dǎo)率的變化較小，即菌渣中的鹽分達(dá)到了較為穩(wěn)定的狀態(tài)。因此，控制頂洗水量3～4 BV較為適宜。

表3 板框壓濾機(jī)操作壓力對菌渣減量化的影響

表4 頂洗水量對菌渣含鹽量(電導(dǎo)率)的影響

3 結(jié)語

(1)采用堿解法，向含固質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的菌渣中加入NaOH，可有效分解菌渣中殘留的阿卡波糖。當(dāng)菌渣中NaOH加入比例為6%、停留時間為6 h時，菌渣中阿卡波糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)可降至30 mg/kg以下，活菌可以完全被殺滅。

(2)采用板框壓濾可以有效降低菌渣中的水分含量，當(dāng)板框壓濾機(jī)操作壓力為1.0 MPa時，菌渣含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)可降至約60%，菌渣減量化效果明顯。

(3)菌渣中的鹽分可以在板框壓濾前水洗去除，當(dāng)頂洗水量為3～4 BV時，菌渣中鹽分的洗脫效率較高。

通過滅活處理，有效降低了阿卡波糖菌渣中的活菌數(shù)，同時去除了其中殘留的阿卡波糖。通過壓濾、水洗，洗脫了菌渣中的鹽分并降低了其水分含量，使菌渣具備了資源化利用的條件。在上述條件下得到的菌渣清除了可能對作物生長產(chǎn)生不利影響的物質(zhì)，但保留了菌渣中的營養(yǎng)物質(zhì)，如有機(jī)質(zhì)、蛋白質(zhì)以及氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素，可進(jìn)一步制成有機(jī)肥料。