酶解與超聲波輔助提取白藜蘆醇工藝優化及其含量的HPLC測定

周亞明 林水森

摘 ? ? ?要：建立超聲波輔助酶法提取葡萄皮渣中白藜蘆醇的有效工藝及其含量的HPLC測定方法，采用單因素實驗和L9（34）正交試驗確定從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇的最佳工藝，并采用高效液相色譜法測定其白藜蘆醇含量。結果表明：酶解與超聲波輔助提取白藜蘆醇的最佳工藝條件為酶解溫度55 ℃，超聲波處理時間30 min，料液比為1∶35，提取時間為4 h，提取溫度75 ℃。提取物的白藜蘆醇平均含量為0.968 5±0.025 mg/g。優選的制備工藝可行、穩定，檢測方法快速、簡便，適用于葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取和分析。

關 ?鍵 ?詞：白藜蘆醇;超聲波;葡萄皮渣;提取工藝

中圖分類號：R284 ? ? ? 文獻標識碼： A ? ? ? 文章編號： 1671-0460（2020）05-0846-05

Abstract： An effective extraction process of resveratrol by ultrasonic assisted enzymatic method was established as well as the determination method of the content by HPLC. The extraction process of resveratrol from grape pomace was optimized by single factor experiment and L9（34） orthogonal design test. The content of resveratrol was determined by HPLC. The results showed that optimal extraction process was as follow： the temperature of enzymatic hydrolysis 55 ℃， the time of ultrasonic treatment 6 min， the ratio of material to liquid 1∶35， the time of extraction 4 h， and the temperature of extraction 75 ℃.The average resveratrol content of extract was 0.968 5±0.025 mg/g. The optimum preparation process was suitable for the extraction of resveratrol from grape pomace，which was feasible and stable. The rapid and simple concentration test method was also suitable for quantitative analysis of resveratrol in grape pomace.

Key words： Resveratrol; Ultrasound extraction; Grape skin residue; Extracting process

最近幾年以來，白藜蘆醇因其多種多樣的活性及特點，開始在國內臨床中通過實驗提取，并在各個相關領域當中廣泛應用[1]。因此，研究提取白藜蘆醇的有效方法具有十分重要的臨床及社會意

義[2]。我國具有十分豐富的葡萄資源，絕大部分都應用在釀酒當中，而釀酒所剩下的大量葡萄皮渣則被當作飼料應用[3-4]。目前，提取白藜蘆醇的主要方法有酶法、超臨界萃取法、超聲波法、熱水浸提法及有機溶劑法等[5]。但兩種及兩種以上方法聯用進行提取的報道較少。酶法當中的纖維素酶可以使纖維發生水解，使植物的細胞壁受到損壞，將細胞當中的內容物充分地釋放出來，更利于提取相關有效成分[6-7]。超聲波法[8]通過超聲波的破碎作用來充分溶出相關生物活性的物質。因此，本文擬通過超聲波輔助酶法從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇，采用單因素分析和正交實驗，以其提取效果為基礎建立最優的提取工藝，同時采用高效液相色譜法（HPLC）測定所提取白藜蘆醇的含量。本實驗的目的在于建立有效的從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇的工藝并測定其含量，有效拓展葡萄皮渣的應用，從中獲得良好的經濟效益。

1 ?實驗部分

1.1 ?實驗儀器

Agilent 1220高效液相色譜儀（美國安捷倫）;色譜柱：Agilent TC-C18（250×4.6 mm，5 μm） ;FA1224S電子天平（德國賽多利斯）;超純水純化系統（南京易普易達）;超聲清洗器（昆山超聲）;旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器）;超聲波萃取儀（寧波新芝生物）;旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 ?實驗材料及試劑

葡萄皮渣（由購自大潤發超市的葡萄制得）：葡萄取皮，將葡萄皮干燥粉碎后，使用60目篩進行過篩;纖維素酶（酶活力：500 000 U/g，浙江一諾生物科技有限公司）;白藜蘆醇標準品（sigma公司）;甲醇、無水乙醇、冰醋酸：購自廣州西隴化工有限公司，均為分析純;超純水為實驗室自制所得。

1.3 ?實驗方法

1.3.1 ?白藜蘆醇提取物制備

（1）白藜蘆醇提取物制備流程

稱取1 g葡萄皮粉于100 mL錐形瓶，加入適量纖維素酶及水進行酶解。pH = 5，酶解時間 1.5 h，酶解溫度55 ℃。酶解后按料液比1∶35加入80%乙醇，將超聲波的功率設置為400 W，超聲波處理30 min，超聲波處理后于75 ℃提取4 h。采用6 000 r/min離心提取液15 min，取上層清液減壓蒸餾，得白藜蘆醇提取物。

（2）白藜蘆醇制備工藝篩選

應用單因素優選法，分別篩選出酶解溫度、超聲波處理時間、料液比、提取時間、提取溫度。

酶解溫度：取粉末適量，添加1.5 mg/g的纖維素酶，pH = 5，酶解時間 1.5 h，設置酶解溫度分別為45、50、55、60、65 ℃，而后按照制備流程提取白藜蘆醇。

超聲波處理時間：超聲波功率設置為400 W，處理時間分別設置為10、20、30、40、50 min，按制備流程進行提取。

料液比：設置料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶49，按制備流程進行提取。

提取時間：設置提取時間為2.5、3、3.5、4、4.5 h，按制備流程進行提取。

提取溫度：設置提取溫度為60、65、70、75、80 ℃，按制備流程進行提取。

根據提取所得白藜蘆醇含量篩選出適宜的酶解溫度、超聲波處理時間、料液比、提取時間及提取溫度。單因素實驗中，白藜蘆醇含量測定采用紫外分光光度法，Y=0.694 2X-0.031 5，R 2=0.994 2，線性范圍為3.95 ～ 17.71 μg/mL。

（3）提取工藝優化

采用L9 （ 34 ） 表進行正交試驗，因素水平見表 1，評價指標為提取物中白藜蘆醇的含量，以此優化從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇的工藝。

（4）不同提取方法的比較

為進一步考察超聲波對從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇的效果，在上述實驗的基礎上，采用4種不同的提取方法，比較其所提取的白藜蘆醇含量。

方法1：稱取葡萄皮粉，按料液比1∶35加入80%乙醇，于75 ℃提取4 h。

方法2：稱取葡萄皮粉，加入纖維素酶及水適量進行酶解。pH=5，酶解時間1.5 h，酶解溫度55 ℃。酶解后按料液比1∶35加入80%乙醇，于75 ℃提取4 h。

方法3：稱取葡萄皮粉，按料液比1∶35加入80%乙醇，超聲波的功率400 W，超聲波處理30 min，超聲波處理后于75 ℃提取4 h。

方法4：稱取葡萄皮粉，加入纖維素酶及水適量進行酶解。pH=5，酶解時間1.5 h，酶解溫度55 ℃。酶解后按料液比1∶35加入80%乙醇，超聲波功率400 W，超聲波處理30 min，超聲波處理后于75 ℃提取4 h。

1.3.2 ?白藜蘆醇含量的HPLC測定

（1）色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（250×4.6 mm，5μm）;流動相為1%甲醇-1%冰醋酸（35∶65）;進樣量為20 μL;流速為1.0 mL/min;柱溫為35 ℃;檢測波長為305 nm。

（2）工作曲線的建立

對照品溶液的制備：精密稱取白藜蘆醇標準品，用甲醇配制成濃度為5.000 mg/mL的對照品溶液。精密量取對照品溶液，分別制成濃度為0.002 5、0.005、0.012 5、0.025 0、0.050 mg/mL的對照品溶液。

按1.3.2項下色譜條件進樣測定，記錄相應色譜峰峰面積，以對照品質量（μg）為橫坐標，相應峰面積值為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為Y=9 154.7X+13.514，r=0.987 5，白藜蘆醇含量在26 ～ 5 320 μg范圍內線性關系良好。

（3）精密度試驗

取上述濃度為0.012 5 mg/mL的對照品溶液，按照1.3.2項下色譜條件連續進樣5次，記錄相應色譜峰峰面積，計算白藜蘆醇峰面積的RSD。

（4）穩定性試驗

取白藜蘆醇提取物溶液，并用微孔濾膜過濾（孔徑0.45 μm），分別于制備后0、1、2、4、6、8 h在1.3.2項色譜條件下進行測定，記錄相應色譜峰峰面積，計算樣品白藜蘆醇峰面積的RSD。

（5）重復性試驗

取白藜蘆醇提取物，制備成6份樣品溶液，按1.3.2項下色譜條件進行測定，記錄相應色譜峰峰面積，計算樣品中白藜蘆醇的平均含量及其RSD。

（6）加樣回收實驗

取同一批次制備的白藜蘆醇提取物，制備成相應的6份溶液，每份精密加入對照品貯備液0.1 mL，微孔濾膜過濾（孔徑0.45 μm），按1.3.2項下色譜條件進行測定，記錄相應色譜峰峰面積，計算平均回收率及其RSD。

（7）樣品含量測定

取不同批次制備的白藜蘆醇提取物適量，制備成相應的溶液，按1.3.2項下色譜條件進行測定，每批次樣品平行測定兩次，記錄相應色譜峰峰面積，計算樣品含量。

2 ?結果與討論

2.1 ?白藜蘆醇制備工藝篩選

白藜蘆醇制備工藝篩選結果見表2。酶解溫度對纖維素酶的酶活性和酶促反應速度有很大的影響。

從表2中可以得知，酶解溫度在55 ℃時，白藜蘆醇的提取含量最高，為0.79 mg/g，大于55 ℃之后，提取含量逐漸降低。 超聲波處理時間在30 min時，白藜蘆醇的提取含量為0.78 mg/g，為最大值。料液比為1∶40時，白藜蘆醇的提取含量最高，但料液比1∶30和1∶35的提取含量與1∶40所得的提取含量相差不大。提取時間為4 h時，白藜蘆醇的提取含量為0.78 mg/g，提取時間延長，提取含量反而降低。提取溫度為75 ℃時，白藜蘆醇的提取含量最高，為0.81 mg/g。通過單因素優選法，初步確定酶解溫度為55 ℃，超聲波處理時間為30 min，料液比為1∶35，提取時間為4 h，提取溫度為75 ℃。

2.2 ?提取工藝的正交優化

在單因素實驗的基礎上，選取酶解溫度（A）、超聲波處理時間（B）、料液比（C）、提取時間（D）作為考察因素進行正交優化實驗，以白藜蘆醇含量為評價指標，結果見表3。通過表3和表4可知，影響提取工藝的因素依次為料液比、提取時間、超聲處理時間及酶解溫度。

料液比對從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇的影響最為顯著，其次是提取時間，超聲處理時間及酶解溫度對提取工藝的影響不明顯。通過正交實驗優化，從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇的最佳工藝組合為A1B2C2D2，綜合單因素實驗，最后確定提取最佳工藝為酶解溫度55 ℃，超聲波處理時間30 min，料液比為1∶35，提取時間為4 h，提取溫度75 ℃。為驗證工藝的可行性和穩定性，在上述條件下，重復3次實驗，提取制備了3份白藜蘆醇提取物，其白藜蘆醇含量平均值為1.018 mg/g，RSD為1.19%。

2.3 ?不同提取方法的比較

不同提取方法提取葡萄皮渣中白藜蘆醇的結果見表5。

從表5可知，加入纖維素酶及采用超聲波輔助均可提高白藜蘆醇的提取含量，超聲波輔助的提取增量作用大于加入纖維素酶，而兩種共同作用可以更為有效地提高提取含量。實驗結果說明超聲波對從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇是有效的。

2.4 ?白藜蘆醇含量的HPLC測定

2.4.1 ?精密度實驗

精密度實驗結果見表6，白藜蘆醇峰面積的RSD為0.92%（n=5），表明儀器精密度良好。

2.4.2 ?穩定性實驗

穩定性實驗結果見表7，白藜蘆醇峰面積的RSD為0.87%（n=6），表明樣品溶液在8 h內穩定性良好。

2.4.3 ?重復性實驗

重復性實驗結果見表8，白藜蘆醇峰面積的RSD為0.64%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.4.4 ?加樣回收實驗

通過峰面積的測定，計算得白藜蘆醇平均加樣回收率為98.08%，RSD為1.82%（n=6）。

2.4.5 ?樣品含量測定

實際樣品含量測定結果見表9。

3 ?結 論

白藜蘆醇在自然植物中廣泛存在，同時具有很高的食藥兩用價值 [9-10]。但從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇進行再利用的研究較少。因此，研究建立了超聲波輔助酶法 [11]提取葡萄皮渣中的白藜蘆醇，并采用HPLC[12]對提取物中的白藜蘆醇含量進行測定，提高了檢測方法的效率和靈敏度同時進行了質量控制。通過單因素實驗、正交實驗研究后，確定了從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇的最佳工藝為：酶解時間1.5 h，酶解溫度55 ℃，酶解后按料液比為1∶35，超聲波處理時間30 min，超聲波處理后于75 ℃提取4 h。該工藝條件下提取所得提取物的白藜蘆醇含量為0.968 5±0.025 mg/g（n=8）。綜上所述，在葡萄皮渣中提取白藜蘆醇時，應用超聲波輔助酶法復合處理的方法可以更加顯著地提高白藜蘆醇的提取含量，同時采用HPLC檢測含量進行質量控制，該工藝穩定性高，可操作性強，靈敏度高，有效拓展了葡萄皮渣的應用。

參考文獻：

[1] 王虹玲，吳優，于子簫，等.釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取及抗氧化、抗腫瘤活性研究[J].中國釀造，2018，10（7）：112-116.

[2] 高原，王福玲，徐蓓蕾，等.葡萄籽中白藜蘆醇的提取及其對LO2細胞氧化損傷保護及延緩衰老作用[J].生物技術通報，2018，34（3）：225-229.

[3]Li P， Zhao Y Q， Fan G X. Quantitative analysis of alkanoate and condensed arenes in the extracts from direct coal liquefaction residue by ultrasonication-assisted solvent extraction using alcohols[J]. Energy Sources Part A Recovery Utilization & Environmental Effects， 2018， 40（10）：1266-1272.

[4] 吳佳，王燕，劉婷，等.大孔樹脂對刺葡萄酒渣中提取的白藜蘆醇的純化工藝研究[J].中國釀造，2017，36（3）：144-149.

[5] 孫詩雯，張笑笛，宋宇.葡萄中白藜蘆醇合成酶基因的克隆及其轉化黃芪研究[J].江蘇農業科學，2017，45（9）：38-41.

[6] 楊祎彬，龔澤華，裘海平，等.重組里氏木霉粗酶液提取虎杖中白藜蘆醇的研究[J].高校化學工程學報，2017，31（5）：1156-1161.

[7] Pelayo， Envo， Esono， et al. Study on the Modifcation of Vacuum Residue by Ultrasonic Radiation[J]. China Petroleum Processing & Petrochemical Technology， 2017， 19（1）：114-122.

[8] 唐春偉，梁宗義，田志龍，等.正交實驗法優香加皮中總黃酮的提取工藝[J].當代化工，2019，48（6）：1166-1169.

[9] 許麗麗，岳倩宇，卞鳳娥，等.褪黑素誘導sts基因表達提高葡萄白藜蘆醇含量[J].食品科學，2018，39（10）：171-178.

[10]車金鑫，師俊玲，羅光武.廣西羅城毛葡萄多酚、黃酮和白藜蘆醇的組成特性及其抗氧化活性研究[J].西北農林科技大學學報：自然科學版，2017，45（7）：107-114.

[11]張國濤.超聲波法提取蕎麥粉中黃酮類化合物的工藝研究[J].當代化工，2017，46（8）：1524-1526.

[12]許志彬，李巧琪，李婷，等.柑橘種子中檸檬苦素的提取工藝優化及分析[J].當代化工，2016，45（10）：2325-2327.